基于HPLC-Q-Exactive MS/MS的二味杜仲汤血浆成分研究

田显庭，董 馨，张秀艳，李春燕，陆景坤，薛培凤＊

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010059；2.呼和浩特市蒙医中医医院药剂科）

骨质疏松症（OP）是一种全身性骨病，其特征是骨量减少和骨微结构严重受损，导致骨脆性增加，容易骨折[1]。骨质疏松症引起的骨折已成为老年人死亡和致残的主要原因之一。随着我国人口老龄化的加剧，骨质疏松症已成为我国面临的重大公共卫生问题。中医认为骨质疏松症与骨萎缩相似，根据中医理论，“肾主骨”“脾主肌”“气血不通则痛”[2]。

目前治疗骨质疏松症的药物以西药为主，大部分为补钙、维生素D、双膦酸盐类、激素类等，虽然这些药物有固定的治疗机制和靶点，具有显著的疗效，但是这些药物副作用明显，往往会对其他组织器官造成影响，因此亟待找到一种疗效显著同时副作用较小的药物[2]。近年来蒙药发展迅速，而其中二味杜仲汤就是一种蒙医常用的治疗骨科疾病的方剂，由杜仲和蓝刺头组成，具有壮骨、接骨疗伤的功效[3]。此方使用多年，副作用较小，而且疗效显著，可以弥补西药的不足。

此药方又名塔布森-2，已有研究中多以体外质量控制和药效研究为主，临床研究表明此方对骨质疏松症有显著的疗效，但是对于效应成分却尚未阐述。药物经过特定的传输途径，入血、代谢、分布进而产生疗效，因此，入血成分有可能是最终的效应成分，所以有必要研究血液中的成分，为进一步明确此方的药效成分和代谢途径提供科学依据[4]。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

咖啡酸（批号：16081502，质量分数≥98%）、绿原酸（批号：SH17101905，质量分数≥98%）、异绿原酸C（批号：SH17120101，质量分数 ≥98%）、异绿原酸A（批号：SH17011305，质量分数≥98%）、原儿茶酸（批号：SH171208，质量分数≥98%）、龙胆酸（批号：SH17030706，质量分数≥98%）、绿原酸B（批号：SH18030501，质量分数≥98%）、阿魏酸（批号：SH17071213，质量分数≥98%）、表儿茶素（批号：16080706，质量分数 ≥98%）、隐绿原酸（批号：SH17103101，质量分数≥98%）、新绿原酸（批号：SH17100904，质量分数≥98%）、京尼平苷酸（批号：SH19011705，质量分数≥98%）、黄芩苷（批号：SH180206，质量分数≥98%）、紫云英苷（批号：SH17103002，质量分数≥98%）、松脂醇二葡萄糖苷（批号：SH18052807，质量分数≥98%）、桃叶珊瑚苷（批号：SH171110，质量分数≥98%）、去乙酰车叶草苷酸（批号：SH180206，质量分数≥98%），以上标品均购自北京赛百草有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲酸（色谱纯，天津永晟精细化工有限公司）。

本研究所用的杜仲、蓝刺头药材经内蒙古医科大学药学院薛培凤教授鉴定，分别为杜仲科植物杜仲（Eucommiau1moidesOliv.）的干燥树皮、菊科植物驴欺口（EchinopslatifoliusTausch）的干燥花序。

1.2 实验仪器

本实验所用到仪器及具体信息见表1。

表1 实验仪器Tab.1 Experimental equipments

1.3 实验动物

Wistar雄性大鼠（购自内蒙古大学实验动物研究中心，SPF级），体质量（240±20）g，许可号：SCXK（内蒙古）2016-01。动物在内蒙古医科大学实验动物研究中心常规饲养。适应性喂养7d，给予标准饲料和饮用水，保持（24±2）℃的室温、（55±5）℃的相对湿度和12 h的暗光周期。实验前禁食12 h，正常饮水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 3 C18-PFP（3μm，100 mm×3 mm）；流动相中有机相（A）为0.2%甲酸甲醇，水相（B）为含0.2%甲酸-超纯水，梯度洗脱程序为：0～0.8 min，2%～5%（A）；0.8～1.7 min，5%～10%（A）；1.7～2.5 min，10%～18%（A）；2.5～3.3 min，18%～23%（A）；3.3～4.2 min，23%～28%（A）；4.2～5.8 min，28%～33%（A）；5.8～9.2 min，33%～43%（A）；9.2～11.2 min，43%～46%（A）；11.2～14.3 min，46%～60%（A）；14.3～16 min，60%～65%（A）；16～17.7 min，65%～68%（A）；17.7～19.2 min，68%～75%（A）；19.2～20 min，75%～80%（A）；20～20.8 min，80%～2%（A）；20.8～24 min，2%（A），流速为0.3 mL/min，4℃自动进样，进样量为5μL，柱温30℃。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI）负离子检测，全扫描（full-scan）模式下获取质谱信息。由于黄酮及酚酸类成分在负离子模式（ESI-）下离子化效果较好，且酚酸类成分在正离子模式下响应较差，因此本文采用负离子模式进行检测。质谱条件如下：①鞘气流速（Sheath gas flow rate）：35 L/min；②辅助气流速（Aux gas flow rate）：10 L/min；③喷雾电压（Spray voltage）：2.8 kV；④毛细管离子传输管温度（Capillary temperature）：350℃；⑤S-lens电压（S-lens RF level）：50 kV；⑥加热温度（Aux gas heater temperature）：150℃。

2.3 原型成分数据处理

首先建立EDD化学成分数据库，通过中国知网、PubMed、ETCM、TCMSP、SymMap等网络数据库或平台检索TFES中各单味药材中的化学成分，建立一个包含化合物名称、化学式和分子量的数据库。将负离子模式下检测到的HPLC-（-）ESI-MS谱导入Xcalibur 3.0软件进行质谱数据处理，得到质荷比（m/z）、保留时间（Rt）等信息，通过高分辨质谱计算出的精确分子量，结合已经完善的数据库信息和对照品的比对，筛选出体内原型成分。质谱偏差范围δ ≤5×10-6。

2.4 体内代谢数据处理

将含药血浆和空白血浆的原始谱图导入到Compound discover3.0软件，并将EDD的体外化合物列表以mol格式导入到数据库中，保留时间误差设为0.3 min，质核比误差为5 ppm，最多反应步数为3。在体内代谢模式下计算每个化合物的所有I相和II相代谢产物，推测各类化合物可能的代谢过程。

2.5 对照品溶液及灌胃药液的制备

2.5.1 对照品溶液的制备 精确称取各对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，使体积恒定。制备每种浓度为1 mg/mL的化合物储备溶液。所有储备溶液储存在4℃的冰箱中，以备日后使用。

2.5.2 灌胃药液的制备 精密称取EDD药材细粉50 g（杜仲、蓝刺头各25 g），置于1 L圆底烧瓶中，加入500 mL蒸馏水，浸泡30 min，100℃，回流提取2次，每次30 min，用180目筛过滤，两次药液混合，浓缩后冷冻干燥，以获得冻干粉供日后使用。使用时用适量蒸馏水溶解，使冻干粉含量为20 mg/mL（相当于EDD生药量83.3 mg/mL）。冻干粉置于4℃冰箱保存备用。

2.6 血浆样品的制备

取雄性Wistar大鼠10只，其中空白组3只，给药组7只。空白组给予5 mL蒸馏水，给药组给予5 mL的药物溶液（相当于3.33 g/kg的EDD冻干粉）。给药组大鼠给药15、30、60、120、240、360 min后，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）用于麻醉，从腹主动脉采血，置于肝素化采血管中，在3500r· min-1下离心10 min，取上层血浆并放置在-20℃下，保存在冰箱中以备日后使用。

2.7 血浆样品的处理

取各时间点血浆200μL，加入3倍量（含0.15%甲酸）乙腈，旋涡并混合1 min，在4℃下以13000r· min-1离心血浆样品10 min以沉淀蛋白质，取上清液，并在室温下用氮气吹干上清液，将残余物溶解在200μL 50%色谱甲醇中，旋涡1 min，在13000r· min-1和4℃下离心10 min，并取上清液供使用。

2.8 样品前处理优化

2.8.1 给药剂量优化 取2.5.2项下冻干粉适量，分别对大鼠进行灌胃给药（剂量分别为1.67 g/kg、3.33 g/kg、5.00 g/kg、6.67 g/kg）。所有大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉。将采集的全血置于5 mL肝素化EP管中，3500r·min-1离心10 min，分离血浆。用乙腈沉淀蛋白法进行处理，并进行质谱分析。其中1.67 g/kg（临床等效剂量的5倍）下检测到的成分数目较少，5.00 g/kg和6.67 g/kg（临床等效剂量的15倍和20倍）无明显差别，3.33 g/kg（临床等效剂量的10倍）下检测到的成分数目最多，且基线最好，故选择3.33 g/kg为最终给药剂量（见图1）。

图1 不同给药剂量的大鼠血浆总离子流图Fig.1 Total ion current diagrams of rat plasma in different doses

2.8.2 采血时间的优选对给药后不同采血时间点的血样进行预处理，通过进样采集质谱数据。综合比较15、30、60、120、240、360 min的谱图，可以发现240 min后谱图中TFES的原型成分已基本消除，因此在给药后15、30、60、120 min收集大鼠。分析用血样，其中120 min时检测到的成分最多且峰形好。

2.8.3 含药血浆沉淀蛋白方法优选为了使待测样品测得的图谱整体响应值更好，峰数目更多，峰强度更高，实验前期对血样的处理方法进行了优化。我们考察了不同蛋白沉淀剂对整体图谱中待测成分的影响。采用乙腈、甲醇分别以不同比例（1∶2、1∶3、1∶4）作为沉淀剂，结果发现乙腈按照1∶3的比例作为沉淀剂时图谱整体峰多，内源性干扰较少，且多数入血成分富集程度较高，响应值较好（见图2）。

图2 不同处理方式的大鼠血浆总离子流图Fig.2 Total ion current diagrams of rat plasma with different treatments

2.8.4 色谱条件优化 本实验前期比较了流动相水相中甲酸的含量（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，v/v）对入血成分分离度和灵敏度的影响，发现当流动相中不加甲酸，以绿原酸、咖啡酸为代表的酚酸成分严重拖尾，低浓度条件下难以基线分离。随着甲酸浓度的增加，酚酸类成分拖尾现象显著改善，但同时黄酮类成分呈现峰面积先增加后减小的趋势，酚酸类成分峰面积明显减小。最终确定以加入体积分数0.2%甲酸超纯水作为水相，方剂血浆图谱整体性较好。

2.9 二味杜仲汤入血原型成分分析

通过建立EDD化学成分数据库，共收集了组方药材中的原型成分246个。通过全面分析含药血浆、空白血浆、EDD方剂、杜仲药材、蓝刺头药材的质谱图，以高分辨质谱计算的精确分子量搜索各图谱准分子离子峰，并通过保留时间比对确认各图谱的共有峰，同时结合二级质谱碎片信息确认药材吸收入血的原型成分。空白血浆中出现共有色谱峰，视为体内的内源性成分，暂不做吸收入血成分分析。大鼠给药2 h后的总离子流图见图3。

图3 给药2 h后大鼠血浆的总离子流图Fig.3 Total ion current diagram of rat plasma two hours after administration

3 结果

通过全面分析含药血浆、空白血浆、EDD方剂、杜仲药材、蓝刺头药材的质谱图，使用高分辨质谱计算的精确分子量搜索各图谱准分子离子峰，并通过保留时间比对确认各图谱的共有峰，同时结合二级质谱碎片信息确认药材吸收入血的原型成分。此外将含药血浆和空白血浆原始图谱导入Compound discover 3.0软件，并将EDD的体外化合物以mol格式导入软件，计算体内代谢模式下各化合物的所有Ⅰ、Ⅱ相代谢产物，获得化合物的保留时间、质量核比、反应类型、匹配度等信息，结合软件分析结果和参考文献推测可能的代谢物。共鉴定出43个入血移行成分，其中有29个原型成分，14个代谢成分。结果见表2、表3。

表2 EDD血浆中原型成分的鉴定Tab.2 Identification of prototype components in EDD plasma

表3 EDD代谢产物鉴定Tab.3 Identification of EDD metabolites

3.1 黄酮类化合物代谢产物

M1保留时间17.973 min，分子式C17H18O7，误差0.531，在负离子模式下准分子离子峰为333.10525，比贯众苷准分子离子峰315.08631多18 Da（H2O）。根据软件分析为贯众苷的水合反应，因此，化合物初步判断为贯众苷的水合产物。

M2保留时间19.52 min，分子式为C19H22O6，误差0.955，在负离子模式下准分子离子峰为345.14164，比贯众苷准分子离子峰315.08631多30 Da（C2H6）。根据软件分析，可能存在还原反应、水合反应、乙酰化反应，最终生成此化合物。

M3保留时间10.7 min，分子式为C18H16O5，误差0.76，在负离子模式下准分子离子峰为311.09977，比贯众苷准分子离子峰315.08631少4 Da（+C-O）。根据软件分析，可能存在甲基化反应，脱水反应最终生成此化合物。代谢规律推导图见图4。

图4 贯众苷在大鼠体内代谢规律图Fig.4 Metabolism of guanzhong glycoside in rats

3.2 苯丙素类化合物代谢产物

M6保留时间12.22 min，分子式为C9H8O3，误差0.819，在负离子模式下准分子离子峰为163.04734，比咖啡酸准分子离子峰179.04226少16 Da（-O）。根据软件分析，可能存在脱水反应和还原反应，最终生成此化合物。

M7保留时间11.14 min，分子式为C11H11NO3，误差1.39，在负离子模式下准分子离子峰为204.07389，比咖啡酸准分子离子峰179.04226多25 Da（-O+C2H3N）。根据软件分析结果，可能存在硝基还原反应，甘氨酸结合反应，最终生成此化合物。

M8保留时间9.73 min，分子式为C9H10O3，误差为0.529，在负离子模式下准分子离子峰为165.06299，比咖啡酸准分子离子峰179.04226少14 Da（-O+2H）。根据软件分析结果，可能存在还原反应，羟基化反应，最终生成此化合物。

M9保留时间7.17 min，分子式为C14H12N2O4，误差为0.047，在负离子模式下准分子离子峰为271.07971，比咖啡酸准分子离子峰179.04226多92 Da（+C5H4N2）。根据软件分析结果，可能存在脱水反应，谷氨酰胺结合反应，最终生成此化合物。代谢规律推导图（见图5）。

图5 咖啡酸在大鼠体内代谢规律图Fig.5 Metabolism of caffeic acid in rats

4 讨论

中药复方成分复杂，而且含量较低，因此进入体内的就更少，代谢产物就少之又少。Q-Exacive MS/MS技术不仅可以提供母离子及多级碎片子离子的精确分子量，且扫描速度快、灵敏度高，是作为体内成分鉴定的理想工具。软件Compound discover可以辅助鉴定血中原型成分的所有Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物[14]。两者结合可以较全面地分析入血成分。生物样本内源性成分对入血成分的检测有很大的影响，因此需要对生物样品进行前处理，减少内源性成分的干扰[15～16]。药物在体内的代谢主要存在于肝组织中，代谢反应主要包括Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢。Ⅰ相代谢是机体经历氧化、还原和水解反应，并将-OH、-COOH、-NH2、-SH和其他极性基团引入母体药物。II相代谢是指药物分子的极性基团和体内具有更大水溶性的内源性化合物如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等共价结合后，形成水溶性高、极性好的代谢物[17～18]。

从EDD的入血成分可以发现，吸收的成分主要集中在黄酮类和苯丙素类，另外还有个别环烯醚萜、倍半萜类等化合物，而且入血的母核也是苯丙素和黄酮类比较多。通过代谢规律分析发现，黄酮类主要的代谢反应有还原、水合、乙酰化、甲基化等I相代谢反应，有个别反应涉及到葡萄糖结合，氨基酸结合反应等II相反应。而苯丙素类化合物主要涉及脱水、羟基化、还原、硝基还原、氨基酸结合等II相代谢反应。总之，部分入血成分通过体内代谢反应增加其极性，便于经过尿液和胆汁排泄，EDD中大部分成分以原型成分进行吸收代谢。但是这些成分是否可以作为此方的药效成分、是否具有这样的代谢途径，还需要进一步通过药效实验、代谢组学等相关方法进行验证。