枇杷低温胁迫下的转录因子分析

于明华，范晨昕，马 烈，郄红丽，王化坤

（1.苏州市园艺站，江苏 苏州 215128；2.苏州市吴江区林业站，江苏 苏州 215202；3.江苏省太湖常绿果树技术推广中心，江苏 苏州 215107）

植物经常遭受到不同的非生物胁迫，比如干旱、极端温度、营养缺乏、盐渍化、重金属残留等，对植物的生长发育及分布造成较大影响．据报道，植物会通过生理和代谢过程、分子改变来应对和适应不利的环境因素[1]．值得一提的是，以果实为主要产出的果树在生长过程中的逆境胁迫下会直接影响到果实的生长及品质．每年秋季的霜冻、冬季的冰冻和初春的倒春寒引起的花果冻害，严重影响果树的生长发育，制约果树的产业化发展．

枇杷（Eriobotrya japonicaL.）是起源于我国的特色高效果树，又是优良的冬季观花观果常绿绿化树，其花、果、叶均可入药，经济价值较高．但冬季的严寒会导致果实、枝叶甚至树体受冻，从而限制其树种的分布和利用[2]．近年来，转录组测序（RNA-Seq）技术的发展为全面量化低温胁迫相关响应基因的表达，分析其网络调控机制以及挖掘重要功能基因提供了重要手段．但枇杷防寒研究多集中于生理生化、细胞超微结构、影响果实冻害因素等方面，分子方面只进行了一些抗寒有关基因的克隆工作[3]，还无法从分子层面说明其抗寒机理，严重滞后于模式植物．此外，目前果树抗寒分子机理研究只有单一树种的报道，内容也只限于抗寒相关基因的克隆和分析．在低温条件下，不同种类果树的主要调控转录因子（Transcriptional factors，TFs）是否存在特异，其调节下游基因表达的机理及过程是否相同，还没有相应的文献进行综合分析．

基于此，本文将低温诱导下枇杷叶片转录组分析序列数据进行在线TFs分析，并与其他现有果树TFs进行综合对比，找出果树转录因子在不同果树上的分布规律，从而探讨枇杷低温反应的分子机制，为枇杷的抗寒基础研究和防寒技术研究提供重要依据．

1 材料与方法

1.1 植物材料

一年生“冠玉”枇杷嫁接苗取自江苏省太湖常绿果树技术推广中心枇杷种质资源圃，江苏省苏州市（32°03′N，124°24′E）．

1.2 TFs分析

枇杷叶片在4 ℃条件下处理4 h，通过RNA-Seq获得转录组数据[4]．将获得的122 081个基因序列数据输入plantTFcat网站（http://plantgrn.noble.org/PlantTFcat/）进行在线TFs分析．下载网站中所有12类果树转录因子数据，并以拟南芥作为对照，使用Excel 软件（Microsoft office 2013）对转录因子的分类、数量、比例等进行汇总分析．

1.3 CBF基因的实时定量RT-PCR分析

在 4 ℃条件下分别在 0（CK），0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h 采集枇杷叶片组织，用于提取RNA并进行CBF基因的实时荧光定量RT-PCR分析，设置3个重复．应用TIANGEN快速试剂盒和20 μL反应体系进行mRNA的分离，反转录成cDNA．然后稀释10倍，取1 μL作为实时定量RT-PCR的模板．基于EjCBF3和EjCBF4的序列，应用Beacon Designer 7软件设计引物（表1）．实时定量RT-PCR反应体系20 μL，10 μL iTaq Universal SYBR Green 混合物，0.4 μL 正反引物．反应程序如下：退火 94 ℃ 4 min，然后 40 个循环（94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 43 s）．应用ABI7300软件进行数据分析．

表1 枇杷实时定量RT-PCR引物

2 结果与分析

2.1 枇杷TFs分析

在122 081个基因中检测出1 308个TFs基因，共分为53类，其中数量在20个以上的有23类（表2），小计1 073个，占所有转录因子的82.03%．数量最多的转录因子是bHLH基因家族，共有96个，占总数的7.34%；次之为NAC基因家族（87个，6.65%）、ERF基因家族（AP2-EREBP，85个，6.5%）、C2H2基因家族（80个，6.12%）、C3H基因家族（75个，5.73%）、MYB_related基因家族（65个，4.97%）、bZIP基因家族（65个，4.97%）、G2-like基因家族（GARP-G2-like，57 个，4.36%）、WRKY基因家族（55 个，4.2%）等，数量均超过50个．这说明枇杷在冷处理下，反应过程很复杂，很多种类的TFs都参与了反应过程，并且诱发了更多的功能基因，这有助于枇杷冷驯化能力的提高．

表2 枇杷TFs汇总

2.2 枇杷TFs基因的表达分析

除TFs的家族类别及检测到的数量外，具体TFs的表达量也与枇杷抗寒机理直接相关．对比所有TFs的转录组表达数据，按相对表达量的大小降序排列所有正向表达的TFs，其中排在前10位的TFs如表3所示．可以看出，CL3864.Contig1_All、CL1945.Contig8_All、CL8139.Contig4_All、CL8139.Contig1_All等 4 个基因都属于CBF（C-repeat binding transcription factor）基因家族，它们在正常情况下不表达，在冷胁迫后特异性表达．除此之外，相对表达量最高的Unigene60904_All也属于CBF基因家族．这说明在冷胁迫下，CBF基因发挥了十分重要的调控作用[5]，与葡萄[6]、柑橘[7]等果树的冷胁迫结果一致，进一步证明CBF基因在植物冷反应荷尔蒙信号途径中的特殊作用．

表3 上调表达前10位TFs

为验证转录组数据的准确性，选取列表中相对表达量最高的Unigene60904_All基因和特异表达第1位的CL3864.Contig1_All基因，编号为EjCBF3和EjCBF4，设计特异引物进行实时荧光定量RT-PCR分析．我们发现EjCBF3和EjCBF4在4 ℃处理不同时间后的基因表达趋势基本一致（图1），但EjCBF4比EjCBF3启动快，表达水平更高，这可能与EjCBF4的特异表达有关．

图1 EjCBF3和EjCBF4在枇杷4 ℃处理后的相对基因表达

2.3 不同种类果树的TFs数量比较

13类果树和拟南芥的TFs总数为27 097个，平均 1 936个．不同果树TFs数量差别很大，其中苹果最多为3 119个；次之为桃、梨、拟南芥、猕猴桃、枣等，数量均超过2 000个；草莓最少，为1 250个．枇杷的转录因子数量也较少，仅为1 308个（表4）．这种数量的不同可能与树种、材料以及不同的处理方法有关．

表4 14种植物TFs汇总

表4 14种植物TFs汇总（续）

2.4 13类果树TFs类别情况分析

13类果树和拟南芥共有58类TFs，其中前10位的分别为bHLH、MYB、ERF、NAC、C2H2（Cys2His2 -type zinc fingers）、MYB_related、bZIP、WRKY、C3H（CCCH zinc finger proteins）、GRAS共 14 633 个，占 TFs总数的 54%（表4）．表5列出了14类植物的前10位TFs，其中bHLH、ERF、NAC、C2H2、MYB_related这5类TFs均出现在14类植物的前10位TFs中．MYB不是枇杷的TOP10 TFs，bZIP不是草莓的TOP10 TFs，WRKY不是桃的TOP10 TFs．C3H存在于枇杷、猕猴桃、苹果、桃、枣、柑橘、葡萄7种果树的TOP10 TFs列表中，而GRAS只存在于枇杷、草莓、核桃和苹果4种果树TOP10 TFs中（表5）．

表5 14种植物主要转录因子类别

表5 14种植物主要转录因子类别（续）

同一转录因子在不同树种间数量差别较大，其中M-type_MADS、MYB、bHLH、NAC等极差数量均在 180个以上，ERF、B3（B3-Domain）、FAR1、bZIP差别100个以上，其他C2H2、MYB_related、WRKY、C3H、GRAS差别在90个以上（见表4）．说明不同植物间特异性差异明显，其基因调控机制也可能有差别．

在 58类 TFs中，RAV（Related to ABI3 / VP1）、VOZ（Vascular plant One Zinc finger protein）、S1Fa-like、HRT-like、SAP、LFY、NZZ/SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）、STAT（Signal transducer and activator of transcription）等8类在不同果树间存在缺失，HRT-like、SAP、STAT在2个树种同时缺失，其他5类只在1个树种缺失．其中枇杷缺失了5个（RAV、SAP、LFY、NZZ/SPL、STAT），核桃缺失了4个（VOZ、HRT-like、SAP、STAT），板栗（S1Fa-like）和梨（HRT-like）各缺失了 1 个．

3 讨论

3.1 TFs在植物逆境中起到较大作用

TFs在植物的生长发育、形态建成等环节发挥重要作用，特别是在应对生物和非生物胁迫中起着关键性作用．自1987年Paz-Ares首次报道玉米TFs基因的克隆以来，相继从高等植物中分离出了数百种调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及生长发育等相关基因表达的TFs．TFs在植物逆境信号转导中是一个非常关键的因素，在胁迫刺激下它们能不断合成，并将信号传递放大，调控下游基因的表达，从而引起植物生理生化的改变，以应对逆境对植物的不利影响[8]．植物主要的冷胁迫反应途径是ABA依赖和ABA独立信号传导途径．TFs和他们的特异性相互作用在分子调节网络中起到重要的作用[9]．本文从枇杷4 ℃处理4 h的叶片转录组122 081个基因中检测出53类、1 308个TFs．说明在冷处理下，TFs发生了较快、较大的变化，从而积极调控下游基因的表达．

3.2 TFs物种间差异大

本文13个果树的TFs种类最多的为58类，最少为53类．数量最多的苹果为3 119个，草莓最少为1 250个，枇杷也较少，仅为1 308个．不同植物间主要的TFs家族不同，在前10类转录因子中，bHLH、ERF、NAC、C2H2、MYB_related5类转录因子广泛存在于所有的14类植物中．

不同植物间转录因子数量和类别差异很大，原因主要与物种本身有关，其中基因组大小、处理条件不同、转录及转录后修饰、调节等因素是主要原因．

3.3 枇杷冷胁迫反应原理

从13类果树TFs数量及枇杷冷胁迫反应中转录组和TFs分析结果来看，bHLH（96个）、ERF（85个）、NAC（87个）等TFs可能在植物冷胁迫下起到了重要作用．

b HLH是真核生物中存在最广泛的一大类转录因子，它处于植物适应逆境胁迫调控网络中较为下游的位置，直接调节逆境胁迫响应基因，调节方式更为具体和精细[10]．ICE（inducer of CBF expression）作为一种bHLH类的转录因子，在低温情况下能够与启动子中的MYC 作用元件特异结合，诱导CBF的表达，进一步结合到COR（cold-regulated genes）启动子的DRE序列，诱导下游基因的表达，继而提高转基因植株的抗寒性[11]．

ERF（AP2-EREBP）分为2个亚族，包括含2个AP2结构域的AP2基因和含有1个AP2/ERF结构域的EREBP基因[12]．CBF作为1个AP2TFs，能够与很多胁迫诱导基因启动子中的DRE/CRT顺式作用元件特异结合，随后调控植物不同类别胁迫诱导基因的表达，提高对干旱、低温、盐的耐性[13]．在植物冷驯化过程中ICE-CBF-COR基因调控途径发挥至关重要的作用[14]．本研究中低温胁迫下枇杷b HLH、ERF是表达最多的2类TFs，其能特异、大量地表达，快速有效地激活ICE-CBF-COR冷反应途径，从而有助于提高枇杷的抗寒能力．CBF基因的转录组数据和实时定量RT-PCR结果也证实了这一结论．

NAC转录因子是近年来发现的一类植物特有的TFs，也是植物基因组最大的转录因子家族之一[15]．在拟南芥[16]、葡萄[17]等多种植物中鉴定出了该基因．本研究中枇杷NAC类TFs共87个，在冷胁迫高表达TFs中居于第2位，说明NAC转录因子在枇杷冷反应中发挥了重要作用．

除常规冷胁迫反应TFs外，CAMTA3是一种受钙调素调节的转录因子．由于冷胁迫处理能够快速诱导植物胞内钙离子的升高[18]，从而激活钙调素，通过调节CAMTA3的转录调控CBF1和CBF2的表达[19]．本研究中枇杷拥有30个CAMTA，是所有14类植物中数量最多的．Kim等研究表明CAMTA1、CAMTA2、CAMTA3经4 ℃ 2 h处理可以诱导CBF1-3最高表达，4 ℃ 24 h处理可以诱导15%的不依赖CBF路径的基因，通过这快慢两种路径提高植物抗寒性[20]．

本研究结果表明枇杷冷胁迫下分子机理相对比较复杂，ICE-CBF-COR和CAMTA快慢两条途径参与其中，bHLH、ERF、NAC类TFs发挥了重要作用．