FR+-CTC、ANXA2、ProGRP与肺癌临床病理特征的相关性

柳行强，宁立芬，李 琳，陈忠成

（武汉科技大学附属汉阳医院检验科，湖北 武汉 430050）

目前，肺癌已成为发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，2020年全球新发肺癌220.7万例，死亡179.6万例[1]。肺癌患者的5年生存率低于15%，大多数患者就诊时已处于晚期[2]。虽然肺癌的治疗方法已取得到了较大的进展，但仍缺乏有效的预后判断指标，导致预后较差[3]。因此，寻找肺癌复发或转移的判断指标，对改善患者预后、提高治愈率具有重要意义。叶酸受体（folate receptor，FR）是一种糖基磷脂酰基醇偶联蛋白，正常人血液中无表达，是理想的肺癌循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）的检测靶点[4]。膜联蛋白A2（annexin A2，ANXA2）是膜联蛋白家族重要成员之一，其异常表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关[5]。胃泌素释放肽前体（gastrin-releasing peptide precursor，ProGRP）能够通过细胞间相互作用或自身分泌导致更具侵略性的肿瘤行为和患者更短的生存期[6]。本研究拟探讨叶酸受体阳性循环肿瘤细胞（folate receptor positive circulating tumor cell，FR+-CTC）、ANXA2、ProGRP在肺癌中的临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年1月—2019年12月武汉科技大学附属汉阳医院肺癌患者116例，其中男76例、女40例，年龄（58.8±8.7）岁。纳入标准：（1）符合《中国肺癌筛查与早诊早治指南（2021，北京）》[7]中关于原发性肺癌的诊断标准；（2）经病理学、影像学确诊；（3）卡氏功能量表（Karnofsky performance status，KPS）评分＞60分，且预计生存期＞6个月；（4）未进行放化疗治疗、靶向治疗等；（5）临床资料完整。排除标准：（1）严重肝、肾功能不全；（2）合并免疫系统、血液系统疾病；（3）合并其他恶性肿瘤；（4）妊娠和哺乳期妇女；（5）合并精神疾病。根据肺癌TNM分期标准[8]分为Ⅰ期40例、Ⅱ期38例、Ⅲ期30例、Ⅳ期8例。另选取同期武汉科技大学附属汉阳医院肺部良性疾病患者100例作为对照组，其中男65例、女35例，年龄（59.2±8.6）岁。肺部良性疾病患者均经组织病理学及影像学确诊，既往无恶性肿瘤史。2个组之间性别和年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经武汉科技大学附属汉阳医院伦理委员会批准，所有对象均知情同意。

1.2 方法

收集所有患者的一般临床资料，包括年龄、性别、影像学报告、血液学检查报告等。采集所有患者入院第2天清晨空腹静脉血6 mL，其中3 mL采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，用于检测FR+-CTC；另3 mL置于无添加剂的干燥真空管中，1 006×g离心10 min后分离血清，用于检测ANXA2、ProGRP水平。（1）FR+-CTC检测。采用免疫磁珠负向富集法捕获EDTA抗凝血样本中的CTC，采用配体靶向聚合酶链反应技术检测FR+-CTC水平。3 mL血液中检测到1个FR+-CTC即判定为1 FU，阳性判断标准为≥8.7 FU/3 mL。试剂盒购自格诺思博生物科技（上海）有限公司，检测仪器为ABI 7300实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。（2）ANXA2检测。采用酶联免疫吸附试验检测血清ANXA2水平，试剂盒购自上海希美化学有限公司，检测仪器为Multiskan FC酶标仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。以ANXA2＞26 ng/mL为阳性。（3）其他指标检测。采用ARCHITECT i2000全自动化学发光免疫分析仪（美国雅培公司）及配套试剂检测ProGRP、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）。以ProGRP＞69.2 pg/mL为阳性。所有项目均严格按仪器和试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用t检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价各项指标诊断肺癌的效能。采用Spearman相关分析评估各指标间的相关性。采用多因素Logistic回归分析评估肺癌发生的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌组与对照组FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比较

肺癌组FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 肺癌组与对照组FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比较

2.2 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP单项及联合检测诊断肺癌的效能

采用Logistic回归分析建立FR+-CTC、ANXA2、ProGRP联合检测的方程：Logist（P）=4.26×ProGRP+1.34×ANXA2+1.09×FR+-CTC-5。ROC曲线分析结果显示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP单项及联合检测诊断肺癌的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.885、0.810、0.696、0.935。见表2、图1。

表2 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP单项及联合检测诊断肺癌的效能

图1 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP诊断肺癌的ROC曲线

2.3 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP与CYFRA21-1、NSE、SCC-Ag的相关性

Spearman相关分析结果显示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP与CYFRA21-1、NSE、SCCAg均呈正相关（P＜0.05）。见表3。

表3 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP与CYFRA21-1、NSE、SCC-Ag的相关性分析

2.4 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP在肺癌患者不同临床病理特征中的表达

根据不同临床病理特征对肺癌患者进行分组。结果显示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP在有吸烟史、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤直径≥5 cm、低分化、有淋巴结转移、有远隔转移的患者中明显升高（P＜0.05）。见表4。

表4 不同临床病理特征肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比较

2.5 影响肺癌发生的危险因素分析

以是否发生肺癌为因变量（否=0，是=1），以FR+-CTC、ANXA2、ProGRP阳性表达为自变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，FR+-CTC、ANXA2和ProGRP阳性均是肺癌发生的危险因素[比值比（odds ratio，OR）值分别为1.385、1.774、1.823，95%CI分别为1.187～4.974、1.601～5.075、1.677～6.005]。见表5。

表5 肺癌发生的危险因素分析

3 讨论

肺癌是起源于支气管黏膜或支气管腺体的一种恶性肿瘤，是多种因素共同作用的结果，常见病因有吸烟、职业暴露、慢性肺炎等[9]。肺癌的发病率位居我国恶性肿瘤的首位，而且发病年龄呈现年轻化的趋势[10]。肺癌患者发病初期多出现发热、咳嗽、胸痛、气短、咯血等症状，容易与其他肺部疾病混淆，造成漏诊、误诊，多数患者就诊时已发展为晚期。肺癌晚期患者的5年生存率仅为5%，而早期肺癌患者的5年生存率可达57%[11]。虽然病理组织活检是诊断肺癌的金标准，但部分患者存在依从性差或不宜手术的情况，取样比较困难。因此，寻求灵敏度高、无需手术的诊断指标，对肺癌患者的早期诊疗尤为重要。

CTC是从实体肿瘤或转移病灶进入人体外周血液的肿瘤细胞。CTC检测是目前最新的液体活检技术，具有方便、快捷、重复性好的特点，适用于肿瘤的早期诊断。随着肿瘤细胞的不断浸润和转移，肿瘤细胞可以通过结缔组织间隙或破裂的毛细血管进入血液循环，形成CTC[12]。叶酸是一种水溶性的B族维生素，人体自身不能合成，必须从外界摄取，通过与细胞表面叶酸受体结合而进入细胞内。叶酸受体在肿瘤细胞中高表达，尤其是肺癌和卵巢癌等多种上皮性肿瘤细胞，而正常组织几乎不表达或低表达。目前，叶酸受体已成为检测人体内CTC的理想靶点[13]。唐兴等[14]发现，FR+-CTC可作为肺癌筛查的指标。ZHOU等[15]认为，FR+-CTC检测是鉴别不明原因肺部孤立结节恶性程度的可靠方法，FR+-CTC计数和热成像诊断技术的联合应用可能会增强术前对肺结节侵袭性的判断，避免非侵袭性病变患者的过度治疗。CHEN等[16]报道，FR+-CTC还可作为预测晚期NSCLC患者化疗效果的潜在的生物标志物。ANXA2是来源于与钙离子相关的蛋白质家族，参与维持肌动蛋白介导的细胞骨架，而细胞骨架的改变与肿瘤的增殖、进展、转移相关[17]。ProGRP是一种胃肠激素，广泛存在于肺组织神经内分泌细胞中，主要作用是刺激G细胞产生胃泌素、收缩平滑肌、促进细胞间相互作用、调节肿瘤转移和生长。ProGRP在小细胞肺癌中显著升高，可用于鉴别肺癌的病理类型[18]。本研究结果显示，肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平显著升高，提示这些指标可能参与了肺癌的发生、发展；ROC曲线分析结果显示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP联合检测可以提高肺癌的诊断效能。

本研究结果还显示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平与吸烟史、TNM分期、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、远隔转移明显相关（P＜0.05），FR+-CTC、ANXA2、ProGRP阳性表达是肺癌发生的危险因素。因此，通过检测FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平有助于了解肺癌患者的临床病理特征和转移情况，评估患者的病情进展和治疗效果。

综上所述，肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平明显升高，且与临床病理特征及肿瘤转移密切相关，是肺癌发生的独立危险因素，联合检测有利于患者的早期诊断、病情评估及预后判断。但本研究属于回顾性研究，标本量较小，且来自同一个地区，可能存在一定地域偏差，有待日后进行大样本量、多中心研究，以期为肺癌的诊断及预后提供全新思路。