血清外泌体、胎盘来源外泌体和外泌体miR-210与子痫前期的相关性

段玉萍，谢 骊，蔡雷鸣，吴晶晶，洪 茂，厉 倩

（1.上海市宝山区吴淞中心医院检验科，上海 200940；2.上海市宝山区吴淞中心医院妇产科，上海 200940）

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种严重威胁孕妇和胎儿健康的妊娠期综合征，发病率为5%～7%，主要临床特征为妊娠20周后出现高血压或蛋白尿，是引起孕妇和胎儿死亡的主要原因[1]。PE的具体病理机制尚不完全清楚，一般认为由内皮功能紊乱、代谢异常、氧化应激增强、炎症反应和高凝状态等引起[2]。

有研究发现，组织特异性外泌体可在疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，如在肺部疾病中具有信号传递的功能[3]，在肠道疾病中具有潜在的生物标志物和靶向治疗作用[4]。有研究发现，在妊娠第6周，孕妇外周血中外泌体的分泌量开始增多，妊娠第6～12周，由于各种病理生理因素的刺激，母体胎盘滋养层细胞分泌的外泌体持续增多，外周血中胎盘碱性磷酸酶（placental alkaline phosphatase，PLAP）阳性的外泌体从妊娠第6周开始也明显增多[5]。微小RNA-210（microRNA-210，miR-210）是低氧诱导RNA，已有研究发现其在PE孕妇胎盘和血清中的表达升高[6-7]，本课题组前期发现在PE孕妇血清miR-210与炎症因子白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）密切相关[8]。目前，临床上尚缺乏早期诊断和预测PE的方法。PE患者在临床症状出现前是否已存在血清外泌体、胎盘来源外泌体（PLAP）和外泌体miR-210水平的变化目前尚不清楚。为此，本研究拟分析不同孕期PE患者血清外泌体和胎盘来源外泌体的差异，以及外泌体miR-210表达的差异，旨在寻找早期诊断和预测PE的方法。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年1月—2019年12月在上海市宝山区吴淞中心医院分娩的PE患者30例（PE组），年龄为22～37岁，初胎比为56.7%（17/30），孕前体质量指数（body mass index，BMI）为（22.5±2.3）kg/m2，PE诊断孕周为（35.1±2.8）周。PE的诊断标准参照第9版《妇产科学》[9]：妊娠20周后出现收缩压≥18.62 kPa（140 mmHg）和/或舒张压≥11.97 kPa（90 mmHg），伴尿蛋白≥300 mg/24 h，或随机尿蛋白（+），或虽无蛋白尿但合并血小板减少、肝功能损伤、肾功能损伤、肺水肿、新发中枢神经系统异常或视觉障碍中任意1项。另选取同期上海市宝山区吴淞中心医院无明确妊娠相关疾病的孕妇30例（正常妊娠组），年龄22～38岁，初胎比为53.3%（16/30），孕前BMI为（23.6±3.2）kg/m2。所有孕妇均排除妊娠感染、妊娠糖尿病，且均为单胎妊娠。2个组之间年龄、初胎比、孕前BMI等一般资料差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经上海市宝山区吴淞中心医院伦理委员会批准，所有对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理 采用真空采血管采集所有对象孕早期（12～14周）、孕中期（20～24周）和孕晚期（28～32周）的空腹静脉血3～5 mL，静置20 min，以1 500×g离心10 min，分离血清，再以12 000×g将血清离心10 min，转移上清液至无RNA酶的无菌容器中，-80 ℃保存备用。

1.2.2 血清外泌体的分离和鉴定 采用ExoQuick试剂（美国System Biosciences公司）分离血清外泌体，严格按试剂说明书操作。简要步骤：将已处理好的血清样本以3 000×g离心15 min，去除细胞和细胞碎片，吸取250 μL血清至洁净的1.5 mL容器内，加入63 μL外泌体提取试剂，震荡混匀后，4 ℃静置30 min，1 500×g离心30 min，弃上清，1 500×g再次离心5 min，弃上清，沉于管底的灰白色沉淀物即为外泌体。采用免疫印迹法鉴定外泌体，采用蛋白裂解液（上海碧云天公司）裂解外泌体蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测总蛋白浓度，试剂购自上海碧云天公司。取30 μg蛋白上样，采用12%聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，80 V电泳30 min，110 V电泳1.5 h。250 mA、1.5 h电转至0.45 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidine difloride，PVDF）膜。转膜后使用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入1∶1 000稀释的CD63（英国Abcam公司），4 ℃孵育过夜。孵育后使用1×三羟甲基氨基甲烷-吐温缓冲液（tris-hydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）洗3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶2 000稀释），室温孵育2 h，1×TBST洗3次，每次10 min。用电化学发光法显影，并用6000型全自动凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）检测蛋白条带。

1.2.3 血清外泌体数量检测 在分离的血清外泌体中加入200 μL磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS），混匀。采用CD63 ELISA试剂盒（美国System Biosciences公司）检测外泌体数量。严格按试剂盒说明书要求操作。

1.2.4 PLAP水平检测 在分离的血清外泌体中加入200 μL PBS，混匀。采用酶联免疫吸附试验检测PLAP水平，试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。严格按试剂盒说明书要求操作。

1.2.5 外泌体中RNA的提取和miR-210检测 采用miRNeasy serum/Plasma kita（德国Qiagen公司）提取外泌体RNA。采用二步法分别进行逆转录和荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。采用miScriptⅡ逆转录试剂盒（德国Qiagen公司）合成cDNA第1链（加尾法），将总体积为20 μL的逆转录体系置于TC-96基因扩增仪（杭州博日公司）中，逆转录条件为37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。采用miScirpt SYBR green PCR试剂盒（德国Qiagen公司）和ABI 7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）进行PCR扩增。采用ΔCt值计算miR-210相对表达量。ΔCt值数值越小，表示miR-210相对表达量越高。具体操作参照文献[8]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。采用Shapiro-Wilk正态性检验评估数据的正态性。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用t检验。采用Pearson相关分析评估PLAP与miR-210的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清外泌体的鉴定

免疫印迹法结果显示，提取的外泌体中有特异性标志CD63表达，提示外泌体分离、提取成功。见图1。

图1 血清外泌体CD63表达

2.2 PE组与正常妊娠组不同孕期血清外泌体数量比较

在正常妊娠组中，孕晚期孕妇血清外泌体数量显著高于孕早期（P＜0.05）。在PE组中，孕中期、孕晚期孕妇血清外泌体数量显著高于孕早期（P＜0.05）。PE组各孕期孕妇血清外泌体数量均显著高于正常妊娠组同孕期（P＜0.05）。见表1。

表1 PE组和正常妊娠组不同孕期血清外泌体数量的比较

2.3 PE组与正常妊娠组不同孕期PLAP水平比较

在正常妊娠组中，孕晚期孕妇PLAP水平显著高于孕早期（P＜0.05）。在PE组中，孕中期和孕晚期孕妇PLAP水平显著高于孕早期（P＜0.05）。PE组各孕期PLAP水平均显著高于正常妊娠组同孕期（P＜0.05）。见表2。

表2 PE组和正常妊娠组不同孕期PLAP水平比较

2.4 PE组与正常妊娠组不同孕期血清外泌体miR-210相对表达量比较

正常妊娠组孕晚期孕妇血清外泌体miR-210相对表达量显著高于孕早期（P＜0.05）。PE组孕中期和孕晚期孕妇血清外泌体miR-210相对表达量显著高于孕早期（P＜0.05）。PE组各孕期孕妇血清外泌体miR-210相对表达量均显著高于正常妊娠组同孕期（P＜0.05）。见表3。

表3 PE组与正常妊娠组不同孕期血清外泌体miR-210 ΔCt值比较

2.5 PLAP水平与外泌体miR-210相对表达量的相关性

Pearson相关分析结果显示，PLAP水平与外泌体miR-210相对表达量呈正相关（r=0.668，P＜0.01）。见图2。

图2 PLAP水平与外泌体miR-210的相关性

3 讨论

PE是一个复杂的妊娠期综合征，目前认为子宫螺旋动脉重塑障碍是PE病因环节中极为重要的一环。子宫螺旋动脉的重塑过程受许多细胞因子和信号转导系统的调节，但具体机制至今尚未被完全阐明。在子宫螺旋动脉重塑过程中起重要调节作用的主要为缺氧诱导因子信号转导系统。在妊娠早期，胚胎对血液需求量的增大与胎盘血供不足之间的矛盾使胎盘氧张力趋于降低，刺激滋养母细胞缺氧诱导因子的表达和复合体形成；而缺氧诱导因子通过诱导转化生长因子β3的表达抑制滋养母细胞的分化和浸润，滋养母细胞分化和浸润的异常表达易导致螺旋动脉重塑障碍[10-11]。体外实验结果表明，在1%的氧浓度环境中，滋养细胞分泌的外泌体数量显著多于8%的氧浓度环境[12]，提示孕期胎盘外泌体或可作为预测和诊断PE的生物标志物。

外泌体是一种由各种活细胞通过内吞-融合-外排等一系列生物学机制产生，并通过主动分泌方式排出细胞膜外的脂质双分子层膜性囊泡，其本质是脂质双分子层，直径为30～100 nm，密度为1.15～1.19 g/mL[13]。外泌体膜富含胆固醇、鞘磷脂等脂质包膜成分，内含有多种蛋白、mRNA和微小RNA，包括其母细胞的特异性蛋白和外泌体相关蛋白，如CD9、CD63、Alix等[14]。因此，外泌体可能是最能反映母细胞内各种物质表达水平的标志物。外泌体的这一特征被广泛研究，如干细胞分泌的外泌体具有促进细胞自我更新和修复的功能[15]，来源于肺部肿瘤组织的外泌体具有促进M2吞噬细胞极化的作用[16]，外泌体还在乳腺癌诊治和消化道肿瘤转移中发挥着重要作用[17-18]。另外，外泌体完整的囊泡结构使其能够用于包裹靶向药物，靶向治疗肿瘤[19]。

血清中外泌体的来源复杂多样，不仅来源于血细胞，还来源于各种组织细胞，包括胎盘来源的滋养细胞。利用外泌体表面的特异性标志物可以对外泌体的组织或细胞来源进行区分。PLAP是一种膜结合的糖基化碱性磷酸酶，主要分布在胎盘，利用PLAP水平可以表征胎盘外泌体的数量[12]。本研究不仅检测了正常妊娠组和PE组不同孕期血清外泌体数量的变化，还检测了胎盘来源外泌体（PLAP）数量的变化，结果与SARKER等[5]报道的结果一致。本研究结果显示，正常妊娠组和PE组血清外泌体数量和PLAP水平均随妊娠进展而逐渐增多，且PE组孕早期、孕中期和孕晚期血清外泌体数量和PLAP水平均高于正常妊娠组同孕期（P＜0.05），提示胎盘来源的外泌体或能在PE的预测和早期诊断中发挥作用。

miR-210是一个与低氧相关的微小RNA，在PE患者胎盘和血清中的表达量高于正常孕妇（P＜0.01）[7]。有研究结果显示，PE患者血清中高水平的miR-210与高水平的IL-6相关[8]。本研究结果显示，PE组孕早期、孕中期和孕晚期血清外泌体miR-210相对表达量均显著高于正常妊娠组（P＜0.05），且外泌体PLAP水平与外泌体miR-210相对表达量呈正相关（r=0.668，P＜0.01），提示血清中升高的miR-210可能主要来源于胎盘。如能进一步分离PLAP阳性的外泌体，并进行miR-210定量检测，应该能更直接地确定miR-210的来源。本研究结果提示外泌体miR-210，尤其是胎盘来源的外泌体miR-210或可在PE的预测和早期诊断中发挥重要作用。

综上所述，PE患者血清外泌体数量、PLAP水平和miR-210相对表达量在孕早期已发生异常，这3项指标或可作为PE预测和早期诊断的良好的生物标志物。