姜黄素对青春前期大鼠睾丸缺血/再灌注Nrf2 蛋白表达的影响*

张建华 孟繁亮 朱 薇 章学文 王 俊 陈思思

湖州市第三人民医院(浙江 湖州 313000)

睾丸扭转是一种常见的泌尿外科急症,该病早期误诊率较高,可达67.6%[1]。 一旦确诊需急诊手术复位,恢复睾丸血供,挽救睾丸功能。 研究发现:睾丸扭转复位是一种典型的缺血/再灌注损伤(Ischemiareperfusion injury, IRI)[2],目前对IRI 的研究主要集中在心、脑血管等方面,对于睾丸损伤后萎缩、生殖细胞凋亡的研究较少。 活化的核因子E2 相关因子-2(NFE2-related factor 2,Nrf2)是内源性抗氧化系统的关键分子,其与细胞核内抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)结合,构成Nrf2/ARE 信号通路,是机体重要的内源性抗氧化应激通路[3]。 目前关于Nrf2 蛋白在心脏和脑组织中的病理生理机制研究报道较多,但关于Nrf2 蛋白在大鼠睾丸缺血/再灌注损伤中的表达、分布规律及作用机制的研究,国内外文献报道较少。本研究通过建立青春前期大鼠睾丸扭转复位动物模型,观察姜黄素(Curcumin,Cur)对青春前期大鼠睾丸扭转复位后Nrf2 蛋白的表达状况的影响,探讨姜黄素对睾丸缺血/再灌注损伤的保护作用机制,为临床治疗睾丸扭转复位后生精功能低下提供理论依据。

一、材料与方法

(一)实验动物、药品及试剂

SPF 级,4 周龄,雄性SD 大鼠,体重(95±5)g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,合格证编号:20170005056712;姜黄素产品,由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供,批号:C1386-5G;Nrf2 多克隆一抗,批号:PB9290,购自武汉博士德生物技术研究所,HRP 免疫组化试剂盒、DAB 试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒,均购自南京建成生物医学工程研究所。

(二)动物模型建立与分组

本实验采用4 周龄雄性健康SD 大鼠32 只,随机分为假手术组、生理盐水组、姜黄素单次给药组和姜黄素连续给药组,每组均为8 只。 所有动物按组分笼饲养。 睾丸扭转模型采用Turner[4]法建立。 舒泰50(50mg/kg)ip麻醉。

假手术组:将左侧阴囊切开,游离左侧睾丸后缝合阴囊,关闭切口。

生理盐水组:将左侧阴囊切开,游离左侧睾丸后,绕精索顺时针扭转睾丸720°后,用1 号丝线固定睾丸,缝合阴囊,关闭切口。 2h 后,第2 次切开左侧阴囊,将扭转的睾丸复位固定,可见睾丸组织由暗红色逐渐恢复红润。 于复位前30min,灌胃法灌注生理盐水(剂量生理盐水200mg/kg)。

姜黄素单次给药组:方法同生理盐水组,于复位前30min,灌胃法灌注姜黄素悬液(采用0.5%羟甲基纤维素钠溶解成悬浊液,剂量Cur 200mg/kg)。

姜黄素连续给药组:方法同生理盐水组,于复位前30min,灌胃法灌注姜黄素悬液(剂量Cur 200mg/kg),术后每天同等药物灌胃1 次,连续7d。

(三)睾丸匀浆的制备和SOD 活性、MDA 含量的测定

于术后6 周处死所有实验动物,取左侧睾丸,剔净睾丸附着筋膜并用冷生理盐水洗净血污,滤纸拭干、称重。 用电子天平称取睾丸组织约0.15g,加入9 倍冷生理盐水并用眼科剪剪碎置于组织匀浆器中,睾丸匀浆以离心力684.21×g 离心15min,取上清液测定各项酶指标。 MDA 和SOD 均采用化学比色法测量。 操作过程严格按照试剂说明书进行。

(四)Nrf2 蛋白表达检测

免疫组织化学染色切片厚4μm,每个标本取4 片,采用免疫组织化学HRP 法染色。 主要步骤:切片常规脱蜡至水→3%H2O2灭活内源性酶→高温高压修复抗原→正常山羊血清封闭(不洗)→滴加Nrf2 抗体(1 ∶3200)→生物素化山羊血清→HRP 试剂(在以上各步之间均用PBS 洗涤3min×3 次)→DAB 显色→苏木素轻度复染,然后脱水、透明,中性树胶封片,光镜观察。阴性对照应用正常IgG 作为对照,用已知阳性片作阳性对照。 以胞质、胞核呈棕褐色为Nrf2 蛋白阳性表达,计算Nrf2 蛋白核转位率。

(五)统计学分析

采用SPSS 22.0 软件,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用SNK法,实验数据以±s表示,P＜0.05 时认为差异有统计学意义。

二、结果

(一)睾丸组织SOD 活性和MDA 含量的变化(见表1)

表1 各组大鼠睾丸组织SOD 活性和MDA 含量的比较(±s,n=8)

表1 各组大鼠睾丸组织SOD 活性和MDA 含量的比较(±s,n=8)

注:*vs 生理盐水组P＜0.05;#vs 姜黄素单次给药组P＜0.05;▲vs 姜黄素连续给药组P＜0.05。

组别 SOD(U/mg*prot)MDA(nmol/mg*prot)假手术组 167.44±4.82*#▲ 11.08±1.01*#生理盐水组 72.70±4.43 35.08±2.59单次给药组 120.99±7.30* 16.87±1.73*连续给药组 154.58±4.62*# 12.76±1.34*#

与假手术组相比,生理盐水组SOD 活性明显降低,MDA 含量显著增加(P＜0.05);与生理盐水组相比,姜黄素单次和连续给药组SOD 活性显著增加,MDA 含量明显降低(P＜0.05);与姜黄素单次给药组相比,姜黄素连续给药组SOD 活性显著增加,MDA 含量明显降低(P＜0.05);与姜黄素连续给药组相比,假手术组SOD活性显著增加(P＜0.05)。

(二)Nrf2 蛋白核转位率变化(见表2)

表2 各组大鼠睾丸Nrf2 蛋白核转位率的比较(±s,n=8)

表2 各组大鼠睾丸Nrf2 蛋白核转位率的比较(±s,n=8)

注:*vs 生理盐水组P＜0.05;#vs 姜黄素单次给药组P＜0.05;▲vs 姜黄素连续给药组P＜0.05。

组别 Nrf2 蛋白核转位率(%)假手术组 33.85±2.41*#▲生理盐水组 42.30±5.04单次给药组 43.71±2.65连续给药组 51.97±4.43*#

与假手术组相比,生理盐水组Nrf2 蛋白核转位率显著升高(P＜0.05);与生理盐水组相比,姜黄素连续给药组 Nrf2 蛋白核转位率显著升高(P＜0.05);与姜黄素单次给药组相比,姜黄素连续给药组Nrf2 蛋白核转位率显著升高(P＜0. 05);与姜黄素连续给药组相比,假手术组Nrf2 蛋白核转位率明显降低(P＜0.05)。

(三)Nrf2 蛋白核转位率和SOD 活性变化(见图1)

图1 Nrf2 蛋白核转位率和SOD 活性变化

(四)睾丸生精小管Nrf2 蛋白表达(见图2)

Nrf2 蛋白主要表达于睾丸精原细胞、精母细胞的细胞核和细胞质。 图2 所示,Nrf2 蛋白核转位率在假手术组最低,缺血再灌注损伤后增强,姜黄素连续给药处理后,Nrf2 蛋白核转位率显著升高,且姜黄素连续给药组Nrf2 蛋白核转位率明显优于单次给药组。

图2 不同组别睾丸组织生精小管Nrf2 蛋白的表达(免疫组化HRP,×200)

三、讨论

睾丸扭转复位是一个典型的缺血/再灌注损伤的过程,虽然扭转的睾丸得到复位后可使血供恢复,但是睾丸在缺血的初期已经发生损害,且在再灌注阶段这种损伤反应会加重。 氧自由基损伤,细胞内钙超载和炎症递质是缺血/再灌注损伤的病理生理基础[5]。 睾丸组织在缺血/再灌注的过程中产生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),ROS 可通过直接损害或者经过一系列过氧化链式反应而造成广泛细胞结构的破坏,因此清除ROS 对减轻睾丸的氧化损伤至关重要。SOD 是组织中清除体内超氧离子自由基经典的抗氧化酶之一[6]。 MDA 是氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的稳定代谢产物,其含量可以间接反映组织细胞损伤的程度[7]。 本实验结果显示,睾丸缺血/再灌注后,睾丸组织SOD 活性明显降低,MDA 含量显著增加,提示睾丸扭转复位可引起大量氧自由基的生成,导致抗氧化能力下降。 姜黄素单次和连续给药组可以显著增加SOD 的活性,明显降低MDA 的含量,提示姜黄素可以降低睾丸缺血/再灌注后氧自由基的生成。

核转录因子NF-E2 相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)是目前为止发现的、最为重要的内源性抗氧化信号通路,是机体重要的自我防御系统,激活Nrf2-ARE 信号通路可增加细胞抗氧化蛋白表达,通过抗凋亡、抑制线粒体膜通透性转换(Mitochondrial permeability transition,MPT)、减轻炎症等机制减轻IRI[8-9]。 正常情况下,Nrf2 与Keap1(Kelch-like ECHassociated protein-1)以相互结合的方式存在于胞质中,其本身活性也受到相应的抑制,处于无活性状态[10]。氧化应激产生的ROS 直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能,是众多疾病发生的病理生理基础。 机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统,当受到氧化应激信号刺激时,会使Nrf2 与Keap1 解除偶联,Nrf2 进入细胞核内,与ARE 结合,从而激活Nrf2/ARE 信号转导通路,启动受ARE 调控的下游一系列抗氧化因子基因如SOD、HO-1、NQO1 等的转录及表达,抗氧化基因的表达上调使细胞的抗氧化应激能力增强[11-12]。 姜黄素(Cur)是一类从传统中药姜黄根茎中分离出的天然产物,为多酚类化合物,其脂溶性好,性质稳定[13]。 实验表明,姜黄素可减轻脑、心脏、肺和肾的缺血再灌注损伤[14-15],其通过抑制黄嘌呤氧化酶、过氧化阴离子、过氧化歧化酶、乳酸脱氢酶等的生成,抑制再灌注损伤导致的细胞凋亡,在缺血再灌注过程中提供保护作用。 本实验结果显示,睾丸缺血/再灌注后,睾丸组织Nrf2 蛋白核转位率显著升高,提示睾丸扭转复位后,氧化应激损伤使Nrf2 释放进入细胞核,激活Nrf2/ARE 信号转导通路,增强抗氧化损伤能力。 姜黄素连续给药组比睾丸缺血/再灌注组Nrf2 蛋白核转位率显著升高,连续给药组比单次给药组Nrf2蛋白核转位率显著升高。

从图1 表明,睾丸扭转后复位前应用姜黄素及术后连续应用姜黄素,Nrf2 蛋白核转位率和SOD 活性显著增加。 推测其机制可能是Nrf2 蛋白核转位在缺血/再灌注时升高,而此期间睾丸组织损伤程度仍加重,提示此期间睾丸组织内对于应激和氧化损伤虽然有保护性反应,通过增加Nrf2 蛋白核转位表达以对抗损伤,但是此作用不足以对抗此期间睾丸缺血/再灌注所释放的活性氧簇、炎性因子等的致损伤作用。 这与程风春[16]报道的结果一致。 应用姜黄素后通过激活Nrf2/ARE信号通路,诱导抗氧化酶SOD 表达,提高睾丸组织清除氧自由基的能力,从而减轻了睾丸组织的氧化损伤。

综上所述,姜黄素通过激活Nrf2/ARE 蛋白的信号通路,提高SOD 活性,清除氧自由基,降低组织内MDA含量,从而对大鼠睾丸缺血/再灌注损伤有保护作用,且连续应用明显优于单次应用。 提示我们在临床工作中对睾丸扭转复位后患者可考虑及时多次连续应用此类药物,以防止出现严重的IRI,从而影响睾丸组织的生理功能和后期发育。