改良化学沉淀法和过氧化物酶法检测冠心病患者血清小而密低密度脂蛋白的方法学比较

解晨曦 毕 波

新疆医科大学第五附属医院检验科，新疆乌鲁木齐 830011

冠心病指由于冠状动脉供血不足，致使心肌 坏死、缺血，导致心脏收缩力减弱、顺应性降低等功能障碍类心血管疾病，已成为严重威胁患者生命安全的疾病之一[1-2]。低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）作为公认的冠心病危险因素，其在颗粒大小、密度与物理化学性质等方面具有异质性[3-4]。将其按照颗粒大小不同，可分为小而密LDL（small dense low density lipoprotein，sdLDL）和大而轻LDL（large and light low density lipoprotein，IbLDL）。sdLDL可作为冠心病的首要脂类危险因素[5]。当前sdLDL的检验方法包括梯度凝胶电泳法、密度梯度超速离心法、化学沉淀法和过氧化物酶法，但梯度凝胶电泳法分析速度慢，且操作繁琐，密度梯度超速离心法所需时间长，且检测仪器昂贵。本研究选择应用较多的过氧化物酶法和肝素镁沉淀法进行比较。但国内对肝素镁沉淀法和过氧化物酶法检测冠心病患者血清sdLDL的相关研究较少，基于此，本研究通过对82例冠心病患者sdLDL进行分析，探讨肝素镁沉淀法和过氧化物酶法的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取82例新疆医科大学第五附属医院2021年1—8月收治的冠心病患者，纳入标准：①冠心病诊断参照《心血管内科学》[6]，经冠状动脉造影确诊为冠心病；认知功能正常者；依从性良好者；临床资料完整者。排除标准：伴有高血压致左心室肥厚者：合并持续性室速、房颤等严重心律失常者；合并严重感染性疾病者。其中男45例，女37例；年龄55～70岁，平均（62.56±4.67）岁；疾病类型：稳定型心绞痛31例，心肌梗死21例，不稳定型心绞痛30例。本研究全部冠心病患者签署诊疗知情同意书，课题立项已获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

入院后，对全部患者均行常规检查，并记录身体相关指标。抽取冠心病患者空腹静脉血，进行离心（3500 r/min，15 min），分离血清，采用AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼，粤械注准：20162220214），三酰甘油（triacylglycerol，TG）与总胆固醇（total cholesterol，TC）使用贝克曼试剂，LDL使用上海蓝怡试剂，sdLDL-C过氧化物酶法使用宁波美康生物试剂（批号：085813），相关步骤严格按照试剂说明书进行。sdLDL-C过氧化物酶法使用特定的离子选择剂和酶，并排除其他脂蛋白胆固醇的干扰，和特定的sdLDL-C选择性反应。首先，在离子选择剂作用下，对sdLDL-C以外的脂蛋白选择性抑制，并将非sdLDL-C成分清除干净。使sdLDL-C在胆固醇氧化酶与胆固醇酯酶作用下，生成过氧化氢，并在过氧化物酶作用下，和色原生成紫红色酶类物质，进而检验sdLDL-C水平。取3 μl血清，与150 μl试剂1[胆固醇酯酶1.5 KU/L，磷酸盐缓冲液100 mmol/L，磷脂酶2.5 KU/L，胆固醇氧化酶1 KU/L，过氧化物酶6 KU/L，N-乙基-N-（2-羟基3-磺丙基）3-甲基苯胺钠盐1.78 mmol/L，1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸盐0.1 ml/L]混匀，37° C孵育5 min，读取吸光度。并与50 μl试剂2（4-氨基安替比林2.5 mmol/L，磷酸盐缓冲液100 mmol/L，乙二按四乙酸50 mmol/L）混匀，37℃孵育5 min，读取吸光度，计算sdLDL-C。

肝素镁沉淀法：将200 μl肝素镁沉淀剂与200 μl血清加入离心管中，混合均匀，在37℃条件下，水浴10 min，随后冰浴15 min。在4℃条件下进行离心处理（16 600 r/min，15 min）。通过全自动生化分析仪检验上清液LDL-C浓度，即为血清sdLDL-C浓度。

1.3 观察指标及评价标准

①sdLDL-C精密度分析：选择sdLDL-C浓度为2.57、1.42、0.21 mmol/L高、中、低水平的样品各1份，每日检测2次，每次均检测2遍，共检测20 d。根据美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）EP5-T2文件[7]评价精密度。②线性分析：取1高值标本（sdLDL-C浓度为2.56 mmol/L）和1低值标本（sdLDL-C浓度为0.15 mmol/L），等量混匀后，制备为中值标本（sdLDL-C浓度为1.36 mmol/L），将中值标本分别与高、低值标本等量混匀后，制备的sdLDL-C浓度分别为1.96、0.76 mmol/L。将上述5个标本分别使用肝素镁沉淀法和过氧化物酶法测定4次，根据NCCLS（EP6-P）的相关评价方案进行线性分析。③肝素镁沉淀法和过氧化物酶法测定sdLDL-C水平的结果：选择患者血清82份，sdLDL-C浓度为0.10～2.59 mmol/L，分别使用肝素镁沉淀法和过氧化物酶法检测sdLDL-C水平，并根据NCCLS（EP9-P）评价方案进行方法学比较。

1.4 统计学方法

结果数据纳入SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，多个样本均数间比较用方差分析；计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝素镁沉淀法和过氧化物酶法检测sdLDL-C精密度分析

过氧化物酶法和肝素镁沉淀法检测sdLDL-C，批间、批内、总变异系数均<2.972%，精密度较好，见表1。

表1 改良化学沉淀法和过氧化物酶法检测sdLDL-C精密度分析（n=43）

2.2 线性分析

线性回归方程分别为肝素镁沉淀法：Y=0.973X+0.025；过氧化物酶法：Y=0.991X+0.023，sdLDL-C水平处于0.10～2.59 mmol/L时，线性良好，肝素镁沉淀法与过氧化物酶法均有良好的相关性，且呈正直线关系（P< 0.05）。

2.3 肝素镁沉淀法和过氧化物酶法测定sdLDL-C水平的结果比较

肝素镁沉淀法和过氧化物酶法测定sdLDL-C水平（TG值<4.0 mmol/L）结果表明，过氧化物酶法测定sdLDL-C水平为（1.18±0.19）mmol/L，肝素镁沉淀法测定sdLDL-C水平为（1.21±0.20）mmol/L，差异无统计学意义（t=0.137，P=0.856）。

3 讨论

冠心病的病机较为复杂，其中血栓形成和心血管动脉粥样硬化在冠心病演变过程中具有重要作用，脂类代谢紊乱为常见表现[8-9]。血清LDL是动脉粥样硬化发生发展的危险因素，随着研究的逐渐深入，sdLDL作为LDL亚组之一，已成为脂质代谢的研究重点，其与冠心病密切相关[10-11]。因此，检测血清sdLDL-C对冠心病的诊治具有重要作用[12-13]。

sdLDL-C作为LDL-C的主要成分，半衰期较长，和sdLDL-C受体亲和性不高，对患者血管壁侵入性较高，且对氧化应激耐受性较低，可作为冠心病的独立危险因子[14-15]。肝素镁沉淀法作为一种通过投加肝素镁沉淀剂，使血液中需要去除的溶解物质转化为难溶物质而析出的处理方式，和传统化学沉淀法相比，具有样本用量少、无需特殊仪器、价格低廉和操作简单等优点，更适用于血清sdLDL-C水平检测[16]。而过氧化物酶法检测使用特定的离子选择剂和酶，并排除其他脂蛋白胆固醇的干扰，和特定的sdLDL-C选择性反应，后使用酶法定量检测其含量。优点在于可直接检测sdLDL-C，受其他脂蛋白胆固醇干扰小，同时不含镁离子，对仪器基本没有损伤，适用于多种生化分析仪[17]。本研究结果显示，过氧化物酶法和肝素镁沉淀法检测sdLDL-C，批间、批内、总变异系数均<2.972%，精密度较好，提示过氧化物酶法检测冠心病患者血清sdLDL-C的精密度较高，有利于为冠心病的诊治和预后评估，为其提供相应参考依据[18]，线性回归方程分别为肝素镁沉淀法：Y=0.973X+0.025，过 氧 化 物 酶 法：Y=0.991X+0.023，sdLDL-C水 平处于0.10～2.59 mmol/L时，线性良好，肝素镁沉淀法与过氧化物酶法均有良好的相关性，且呈正直线关系（P< 0.05），提示过氧化物酶法与肝素镁沉淀法相比较，TG值<4.0 mmol/L时，对于结果检测的相关性良好，而TG值>4.0 mmol/L时，不利于使用F计算法。肝素镁沉淀法和过氧化物酶法测定LDL-C水平（TG值<4.0 mmol/L）结果比较，差异无统计学意义（P> 0.05），提示TG值<4.0 mmol/L时，肝素镁沉淀法和过氧化物酶法测定结果均不受TG值影响，TG值>4.0 mmol/L时，肝素镁沉淀法和过氧化物酶法测定结果有一定差异。通过肝素镁沉淀法和过氧化物酶法检测冠心病患者血清sdLDL-C，有利于为临床提供可靠的检验数据，进而指导冠心病筛查与治疗。但本研究仍存在不足之处，如研究样本数量较少，不能对肝素镁沉淀法和过氧化物酶法检测冠心病患者sdLDL-C的精密度做出准确判断，因此，临床可扩大样本数量进行研究，以进一步提高研究结果的准确性。

综上，肝素镁沉淀法和过氧化物酶法的相关性良好，对于冠心病患者血清sdLDL-C均有较好的检测效果，但过氧化物酶法更为快速、简便，更有助于sdLDL检测标准化的实施，值得临床广泛推广。