蓝刺头中总黄酮的含量测定

罗爱勤 曹颖男 钟春燕

广州新华学院，广东广州 510520

蓝刺头是菊科植物蓝刺头（Echinops LatifoliusTausch.）的干燥头状花序[1]，收载在《中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册》[2]中，蒙药名为扎日阿-乌拉；其药性苦、稀、轻、柔、钝、凉，可固骨质、接骨愈伤、清热止痛，用于骨折、骨热、刺痛症、疮疡[3]。现代药理研究表明，蓝刺头能显著改善PMOP大鼠氧化应激状态；可交叉调控FoxO/Wnt/β-catenin通路，抑制氧化应激FoxO转录，上调Wnt表达,促进模型鼠骨成骨分化、骨形成[4]。蒙药蓝刺头的化学成分主要包括生物碱类、黄酮类和三萜类等[5]，有多篇文献报道从蓝刺头中分离出黄酮类化合物，主要为芹菜素及其苷类化合物[5-7]。刘岩等[8]研究发现蓝刺头总黄酮可通过类雌激素样作用，降低血清BGP水平，上调去卵巢大鼠ERα和ERβ的表达，从而促进骨形成，调节骨吸收与骨形成的耦联，降低骨转换率，减少骨丢失，可有效防治绝经后骨质疏松症。蓝刺头质量标准中仅有性状鉴别、性味、功能主治、用法用量和贮藏项目，没有指标成分的含量测定项，本课题拟建立一个适合蓝刺头总黄酮的含量测定方法，为评价蓝刺头药材质量提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BS210S型电子天平（德国Sartorius）、Agilent8453-E紫外分光光度计（美国）、KQ-400GKDV超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）

1.2 试药

芹菜苷标准品（上海铭博生物科技有限公司，批号B200823，≥98.0%），蓝刺头药材（保定仙德中药销售公司，批号191011、191101、191201），其他试药均为分析纯，纯化水。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备

取芹菜苷标准品适量，精密称定，置100 ml量瓶中，加60%乙醇制备成每毫升含芹菜苷0.30 mg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取蓝刺头药材（批号191101），粉碎使通过60目筛，再取药材粉末1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入60%乙醇100 ml，称定重量，超声提取1.5 h，放冷，补足损失重量，滤过，收集滤液，即得。

2.3 显色剂和测定波长确定

取芹菜苷标准品溶液0.1 ml和供试品溶液0.5 ml，分别加入5%三氯化铝溶液3.0 ml反应15 min后，按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0401紫外-可见分光光度法（UV-Vis）[9]，于200～600 nm波长范围内进行光谱测定，见图1～2。

图1 芹菜苷标准溶液UV-Vis图

图2 供试品溶液UV-Vis图

从图1～2中可看出，芹菜苷标准品和供试品与5%三氯化铝溶液反应后，在吸收带Ⅱ中有一波长为275±2 nm的共同吸收峰，因此确定5%三氯化铝溶液为显色剂，275 nm为测定波长。

2.4 线性关系考察

取芹菜苷标准品溶液，精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分别置10 ml量瓶中，加5%三氯化铝溶液3 ml，再加60%乙醇至刻度，摇匀，放置30 min，在275 nm波长处进行吸光度测定，以吸光度为纵坐标，芹菜苷质量浓度为横坐标，进行线性回归分析，得回归方程为Y=0.0357X-0.0065（r=0.9999），芹菜苷质量浓度在3.28～32.80 μg/ml范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取芹菜苷标准品溶液，精密量取0.3 ml，按照2.3项下的线性关系考察条件进行测定，连续测6次，得到标准溶液吸光度值分别为0.3433、0.3475、0.3479、0.3460、0.3466、0.3468，相对标准偏差（RSD）为0.473%，表明本测定法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液分别于显色后30、45、60、75、90、120 min进行测定，测得吸光度值分别为0.4425、0.4413、0.4400、0.4389、0.4379、0.4228，RSD为1.660%，表明供试品溶液中总黄酮显色后在2 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取蓝刺头药材（批号191101）6份，每份约1 g，精密称定，按照2.2项下的方法制备样品溶液，精密吸取样品溶液0.5 ml置10 ml量瓶中，测定吸光度，代入回归方程计算样品溶液中总黄酮的质量浓度，供试品溶液中总黄酮的质量浓度（μg/ml）=（吸光度值+0.0065）/0.0357；再计算药材中总黄酮的含量（含量%=供试品溶液中总黄酮的质量浓度×10-6×稀释倍数/取样量×100%；稀释倍数=10×100 ml/0.5 ml=2000），见表1。

从表1结果可知，蓝刺头药材的总黄酮平均含量为2.33%，RSD=0.956%（n=6），表明本法具有良好的重复性。

表1 重复性试验结果

2.8 准确度试验

采用加样回收法，取蓝刺头药材（批号191101）6份，每份约0.6 g，精密称定，准确加入芹菜苷溶液1 ml（13.00 mg/ml），按照2.2项下的方法制备样品溶液，精密吸取样品溶液0.5 ml进行测定，计算实测量和回收率，见表2。

从表2结果可知，本法所测得的回收率均为95%～105%，RSD=0.923%，符合考察要求。

表2 准确度试验结果

2.9 总黄酮含量测定

取蓝刺头药材（批号191011、191101、191201），分别按2.2项下的方法制备样品溶液，精密吸取样品溶液0.5 ml置10 ml量瓶中，测定吸光度，计算药材中总黄酮的含量，见表3。

从表3结果可知，本法测定3批蓝刺头药材中总黄酮的平均含量为2.30%，3批蓝刺头药材的总黄酮含量较接近。

表3 3批蓝刺头药材中总黄酮的含量

3 讨论

具有3’，4’-邻二酚羟基的黄酮类化合物，能与亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠试剂反应产生红色物质，并在500 nm处有吸收，但该法专属性不强[10]，因为含邻二酚羟基的非黄酮类物质，如绿原酸、咖啡酸、原儿茶醛等[11]也呈阳性反应，而不具有邻二酚羟基的黄酮类物质则不能被测定出来。芹菜素及其苷类化合物是5，7，4’-三羟基黄酮类化合物，结构中无邻二羟基，与亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠试剂反应无红色物质产生，在500 nm处也无吸收。目前有文献[12-14]报道，采用三氯化铝比色法测定植物中的总黄酮含量，主要因为此法在误差范围内准确度较高，对黄酮类化合物的专属性较强，显色反应时黄酮类物质反应较强，而色素、酚酸等非黄酮类物质的反应极弱。

芹菜苷结构中的5-羟基、4-羰基，能与5%三氯化铝溶液反应产生在紫外光275±2 nm处有吸收的络合物[15]，本研究利用此原理建立测定法测得蓝刺头药材中总黄酮含量约为2.30%，与李爽等[16]研究检测结果23.57 mg/g和舒合拉·朱马别克等[17]研究检测结果26.65 mg/g基本一致。本测定法经方法学验证重复性、精密度、稳定性和准确度较好，且操作简便、快捷，成本低，有一定实用价值，值得推广，但是紫外-可见分光光度法也有不足之处，仅适用于微量分析，对于高浓度物质，吸光度和浓度之间的关系会发生偏离。以HPLC法测定几个主要黄酮成分的含量，能更精准地评价和反映中药材中总黄酮的质量[18]，本项目课题目前也在进一步开展HPLC法测定黄酮成分的研究。