基于数据挖掘探究兰艾双香方诱导大肠杆菌K12菌株铁死亡机制研究

张振华 宋 健 孟凯强 胥 冰 王 斌 沈舒文 张瑞凡 王紫慧 苏 辉王 卓 冯天照陕西中医药大学，陕西咸阳 712046

随着中药药理学对中药有效成分及作用蛋白研究的不断加深，中药在抗菌、抑菌方面的显著疗效逐渐被展示。宋健副教授科研团队通过现代工艺技术，对名老中医沈舒文教授的临床经验方剂—兰艾双香方，进行了中药新剂型改良，作为新型消毒剂。通过数据挖掘，检索兰艾双香方的有效成分及对应蛋白，建立数据库并对其进行分析，共获得兰艾双香方蛋白265个；其中“MG1655”样品中共有17个作用蛋白，“W3110”样本中有5个作用蛋白，fhuA（ferrichrome outer membrane transporter）是在大肠杆菌K12抑菌过程中诱导大肠杆菌发生铁死亡的关键蛋白，提示兰艾双香方中存在的铁色素外膜转运蛋白在大肠杆菌铁死亡进程中发挥作用。为后续开展中医药抑菌、抗菌作用的研究提供了一定基础。

随着中药药理学的发展，对中药有效成分及作用蛋白的开发和研究不断加深，已证实如藤梨根、藿香、羌活、艾叶等中药中的酚类、黄酮类、生物碱类、萜类等多种单体化合物有明显抗菌作用。中药在抑菌方面的疗效十分显著，刘继敏等[1]开发的以苦参、蛇床子、甘草、冰片、薄荷脑为原料的奥肤舒消毒液主要针对白念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，通过抑菌试验发现其对以上三种常见致病菌有明显抑制作用。冯立民等[2]开发的以苦参、蛇床子、大黄等水煎提取液加芳香油制成的消毒液在抑菌试验中对常见致病菌有明显作用。冼桂江等[3]以中药黄柏、蛇床子水煎提取液配合氯己定的悬浊液作为中药消毒液通过在悬液定量杀菌试验，发现其有明显的抑菌效果。兰艾双香抑菌消毒液是针对常见致病菌的抑菌消毒液，该消毒液是以抑菌中药复方兰艾双香方为基础，通过现代蒸馏提纯等技术，在国家级大学生创新创业项目专项经费的支持下，设计并完成的中药新剂型改良项目。其组成为羌活、独活、石菖蒲、藿香、苍术、丁香、薄荷、贯众、苦杏仁、半枝莲、佩兰和艾叶，该方是名老中医沈舒文教授与宋健副教授丰富中医临床经验的凝练，多年来一直作为治疗细菌感染的临床基础方。

铁死亡（ferroptosis）是指主要依赖于细胞内脂质活性氧（L-ROS）和铁累积所引起的细胞凋亡过程。Dolma等[4]在2003发现了一种不伴有细胞核形态改变、DNA断裂以及半胱天冬酶激活的新细胞凋亡模式的新化合物“Erastin”，并且发现这一细胞凋亡过程不能被（如半胱天冬酶抑制剂等）凋亡抑制剂抑制。Dixon等[5]于2012年将该细胞凋亡过程正式命名为“铁死亡”，是一种新的调节性细胞凋亡形式。促使细胞发生铁死亡的诱导方式多种多样，包括p53质粒包裹金属有机网络的MON-p53[6]、纳米氧化铁[7]、FePt纳米粒子[8]、酰基辅酶A合成长链家族成员4（ACSL4）[9-10]等。除此之外，相关方剂和中药也可导致铁死亡的发生，如黄芩汤、四物汤、淫羊藿、干姜、高良姜、麦冬、花椒、青蒿等。

本研究通过对兰艾双香方进行分子层面的讨论，探究其在大肠杆菌K12抑菌过程中诱导大肠杆菌K12铁死亡的机制。

1 资料与方法

1.1 数据来源

分别以“羌活、独活、石菖蒲、藿香、苍术、丁香、薄荷、贯众、苦杏仁、半枝莲、佩兰和艾叶”十二种物质检索中国知网及中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）等，对兰艾双香方的有效成分及蛋白进行收集整理。以“Iron Death”在Uniptot数据库中搜索铁死亡相关蛋白，该结果将作为铁死亡的相关蛋白。

1.2 纳入标准

①所选复方兰艾双香方蛋白对应的有效成分需同时满足口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18两个条件；②铁死亡相关蛋白需为大肠杆菌K12物种，剔除其他物种的铁死亡相关蛋白；③所有组别的蛋白需删除该组重复项内容，多次出现按照一次计算，不做出现频次的累积。

1.3 数据录入和标准化

将所有涉及的蛋白质名称以及基因名称进行标准化处理，运用国际专用缩写，如“Ferrichrome outer membrane transporter”“Ferric hydroxamate receptor”“Ferric hydroxamate uptake”“Ferrichromeiron receptor”“JW0146”统一规范为“fhuA”。

1.4 数据分析

运用Excel及相关数据库筛选兰艾双香方中对大肠杆菌铁死亡起作用的蛋白，对特定蛋白的作用进行分析。构建兰艾双香方核心蛋白与其他蛋白之间的蛋白网络，并分析其作用关系。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选结果

利用TCMSP数据库检索共收集得到兰艾双香方的化学成分，根据OB≥30%和DL≥0.18为指标进行筛选，得到复方中共138个活性化学成分，包括羌活（15个）、独活（9个）、石菖蒲（4个）、藿香（11个）、苍术（9个）、丁香（6个）、薄荷（10个）、贯众（7个）、苦杏仁（19个）、半枝莲（28个）、佩兰（11个）和艾叶（9个）的化学成分；结合相关数据库将有效成分的对应蛋白进行整理，共获得兰艾双香方蛋白265个。

2.2 药物针对大肠杆菌K12作用蛋白筛选结果

将兰艾双香方265个蛋白导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/），物种选择“Escherichia coli K12”两个不同的样本“MG1655”和“W3110”，分别获得在两种不同的大肠杆菌K12的作用蛋白，“MG1655”样品中共有17个作用蛋白、“W3110”样本中有5个作用蛋白，见图1～2。

图1 大肠杆菌K12（MG1655）

图2 大肠杆菌K12（W3110）

2.3 铁死亡过程中核心基因筛选

将兰艾双香方和大肠杆菌铁死亡两组蛋白准备好后，导入Jvenn中，作出两者的交集[11]，即为本研究核心蛋白，仅有1个核心蛋白—fhuA，fhuA蛋白是在大肠杆菌K12抑菌过程中诱导大肠杆菌发生铁死亡的关键蛋白。

3 讨论

fhuA蛋白为铁色素外膜转运蛋白，与铁铬（一种异羟肟酸盐型铁载体）复合参与铁的吸收，结合并转运铁铬铁穿过外膜；除了在铁色素-铁转运中的作用外还可转运抗生素白霉素，是铁色素的结构类似物，并作为大肠杆菌素M、小菌素J25和噬菌体T1、T5、phi80和UC-1的受体[12-14]，其二级结构和结构示意图见图3～4。

图3 fhuA二级结构示意图

图4 fhuA结构示意图

兰艾双香方中多种中药均有明显抑菌作用，李美雎等[15]通过对比发现青海不同产地宽叶羌活均存在特异的抗菌活性，可作为宽叶羌活抗菌药物开发物质基础。王小云等[16]通过抑菌试验发其化合物羌活挥发油对铜绿假单胞杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。刘杰等[17]发现佩兰提取的黄酮成分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌等具有一定的抑菌作用。贺富胤等[18]通过试验发现石菖蒲提取物对猕猴桃溃疡病菌产生抑菌作用的较佳提取工艺，且同条件下，复配物有更强的抑菌作用。曾婷等[19]通过正交试验等发现佛手、艾叶、广藿香和云木香配比为2∶1∶4∶2时，该配方具有良好抑菌效果，并且以该处方为基础研发了一款新型抑菌香皂。兰艾双香方的药物为具有抑菌作用的常用中药，该方也是细菌感染的临床常用方，在临床中有明显疗效。

中药可通过多种成分在多种途径发挥抑菌作用，复杂的抑菌途径难以明确其准确的抑菌过程，本研究通过对大肠杆菌K12菌株的铁死亡过程进行研究，拟发掘兰艾双香方在催化大肠杆菌进行铁死亡过程中产生作用的蛋白。通过数据发掘的方式，发现兰艾双香方中存在的铁色素外膜转运蛋白在大肠杆菌铁死亡进程中发挥作用，为后续开展诱导常见大肠杆菌等常见致病菌发生铁死亡从而发挥抑菌作用提供了基础。