真菌病毒减弱寄主致病性机理及其生防应用

聂建华，张理航，张明明,3，郭立华，陈 伟，王双超*

（1. 山西师范大学生命科学学院，太原 030000；2. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193；3. 比利时列日大学让步卢农学院，让步卢 5030）

真菌病害占植物病害的 70%～80%以上，严重降低作物的产量和品质。在过去 50年里，对农作物真菌病害的防治主要依赖化学农药，而化学农药的过度使用威胁食品安全，导致环境污染和病原菌抗药性增强。真菌病毒是能够在真菌细胞内复制和增殖的病毒，其中一些真菌病毒侵染后能够减弱植物病原真菌的致病性，从而可用于植物病害的防治。真菌病毒作为一类新型的生防因子，具有绿色、环保、安全等优点，以真菌病毒为核心的生防产品的研发和应用能够减少化学农药用量、延缓病原菌的抗药性。本文综述了真菌病毒减弱寄主致病性机理及其在病害防控中的应用，同时提出了真菌病毒用于生物防治的前景和面临的问题，为植物真菌病害绿色防控提供参考。

1 真菌病毒概述

1.1 真菌病毒的分类

真菌病毒广泛存在于各大真菌类群中，根据其基因组组成及复制方式，真菌病毒可分为5种类型：双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）病毒、正义单链RNA（positive single-stranded RNA，+ssRNA）病毒、负义单链RNA（negative single-stranded RNA，-ssRNA）病毒、逆转录单链RNA（RT ssRNA）病毒和单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）病毒。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的最新报告（https://talk.ictvonline.org/），真菌病毒共分为26个科。其中，dsRNA真菌病毒包含9个科：葡萄孢双节段病毒科Botybirnaviridae、产黄青霉病毒科Chrysoviridae、弯孢霉病毒科Curvulavirida、巨型双节段病毒科Megabirnaviridae、双分病毒科Partitiviridae、多菌病毒科Polymycoviridae、四分体病毒科Quadriviridae、呼肠孤病毒科Reoviridae和全病毒科Totiviridae。+ssRNA真菌病毒包含12个科：甲型线形病毒科Alphaflexiviridae、杆菌状核糖核酸病毒科Barnaviridae、葡萄孢欧尔密病毒科Botourmiaviridae、丁型线形病毒科Deltaflexiviridae、内源病毒科Endornaviridae、镰刀菌病毒科Fusariviridae、丙型线形病毒科Gammaflexiviridae、哈达卡病毒科Hadakaviridae、低毒病毒科Hypoviridae、线粒体病毒科Mitoviridae、裸露病毒科Narnaviridae和亚多卡利病毒科Yadokariviridae。-ssRNA真菌病毒包含2个科：单股负链RNA病毒科Mymonaviridae和白纤病毒科Phenuiviridae。RT ssRNA真菌病毒包含2个科：转座病毒科Metaviridae和假病毒科Pseudoviridae。ssDNA真菌病毒目前报道包含1个科—类双生病毒科Genomoviridae。还有很多已报道的真菌病毒尚未确定其分类地位。

1.2 能够减弱寄主致病性的真菌病毒

真菌病毒可侵染绝大多数真菌类群，其中大部分病毒表现为隐性侵染，但也有少量病毒可减弱寄主真菌的致病性、抑制其生长，这些病毒是防治真菌病害的潜在生防资源。目前已在多种病原菌中鉴定到可以减弱寄主真菌致病性的病毒（表1）。核盘菌Sclerotinia sclerotiorum严重危害大豆、油菜等油料作物和莴苣等蔬菜生产[1]，目前从核盘菌中已鉴定出8例能够减弱寄主致病性的病毒，其中SsHADV-1（Sclerotinia sclerotiorumhypovirulence-associated DNA virus 1）是从核盘菌DT-8菌株中分离到的第1例DNA病毒[2-9]。栗疫病菌Cryphonectria parasitica感染栗树引起严重的栗疫病，使板栗产量和质量明显下降，从栗疫菌中分离到 CHV1～4（Cryphonectria hypovirus 1～4）共 4例低毒病毒科病毒[10-13]。禾谷镰孢菌Fusarium graminearum可引起小麦赤霉病，从中分离到2例低毒病毒科病毒[14,15]。真菌病毒的传播方式主要分为水平传播和垂直传播。水平传播是病毒通过感病寄主与其他菌株的菌丝融合进行传播；垂直传播则是通过有性或无性孢子进行传播，多数真菌病毒可通过无性孢子传播，而有性孢子的传毒率很低。近期研究发现，真菌病毒还可通过昆虫介体进行传播，侵染核盘菌的SsHADV-1病毒会随着厉眼蕈蚊Lycoriella ingenua的取食传播到其他菌丝[16]。

表1 部分减弱植物病原真菌致病力的真菌病毒Table 1 Part of mycoviruses that attenuate the virulence of plant pathogenic fungi

2 真菌病毒减弱寄主致病性机理

2.1 抑制寄主真菌生长发育相关基因的表达

减弱病原真菌致病力的真菌病毒侵染会影响寄主基因的表达。Allen和Nuss[17]对感染CHV1病毒的栗疫菌基因表达分析发现，强毒菌株CHV1-EP713中132个基因表达水平上调、163个基因下调，弱毒菌株CHV1- Euro7中90个基因上调表达、76个基因下调表达，差异基因数量明显减少。Wang等[18]发现禾谷镰孢菌被FgHV1侵染后378个基因差异表达，其中多数是生长发育相关的关键基因。Lee等[19]通过转录组测序发现，SsHV2-L侵染后寄主核盘菌编码的细胞色素P450和甲基转移酶等生长发育关键基因的mRNA表达量显著增加。Li等[20]通过northern blot分析发现，SsDRV侵染的核盘菌差异表达基因都与能量转换等生长相关基因有关。Gao等[21]研究表明，SsNSRV-1编码的ORF I蛋白调控寄主生长发育相关基因的转录、翻译和修饰。过表达ORF1蛋白的菌株表现出与SsNSRV-1侵染类似的表型，菌株的致病力均降低，表明ORF1蛋白是减弱寄主致病性的关键因子。真毒病毒通过调控寄主真菌基因表达从而改变寄主蛋白丰度。Wang等[22]对低毒病毒CHV1侵染的栗疫菌蛋白水平进行测定，共检测到33个蛋白存在差异表达，其中下调的蛋白多为参与代谢和能量转换的转运蛋白，上调的蛋白多为囊泡相关蛋白。研究还发现CHV1编码蛋白p48过表达菌株中存在4种不同分子质量的囊泡。

2.2 抑制寄主RNA沉默

减弱病原真菌致病力的真菌病毒会影响寄主RNA沉默这一抗病毒反应。RNA沉默（RNA干扰）是真核生物抗病毒的重要防御反应[23]。植物、动物和微生物等具有相同或相近的RNA沉默机制。当病毒侵染导致细胞内的dsRNA积累后，RNA沉默系统被诱发。在Dicer-like（DCL）酶的作用下，dsRNA被切割形成20～30 nt长度的双链小分子RNA，称为siRNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA被整合到Argonaute蛋白中，形成RISC复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），进而靶向切割与siRNA同源的病毒基因组，从而抑制病毒增殖。RNA沉默信号依赖RdRp（RNA dependent RNA polymerase，RdRP）促进 siRNA积累，将信号级联放大。根据发生位点和作用方式，RNA沉默分为转录水平上的基因沉默（Transcriptional Gene Silencing，TGS）和转录后的基因沉默（Post Transcriptional Gene Silencing，PTGS）。目前，真菌病毒相关的RNA沉默研究主要集中在PTGS。

真菌RNA沉默抗病毒防御反应首先在栗疫菌中发现。在长期的进化过程中，真菌病毒通过编码RNA沉默抑制子抵御寄主的 RNA沉默。已被鉴定出的真菌病毒抑制子包括 CHV1-p29[24]、MyRV3-s10[25]、FgV1-ORF2[26]和CHV4-p24[27]。研究表明，RNA沉默抑制子p29通过抑制Cpdcl2和Cpagl2的转录激活来抑制寄主 RNA沉默，近期发现在栗疫菌中 RNA沉默需要转录激活因子 SAGA（Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase）结合从而上调Cpdcl2和Cpagl2的表达[28]。Yu等[26]发现禾谷镰孢菌病毒FgV1编码的ORF2具有DNA结合能力，可以抑制Fgdicer2和Fgago1的转录，从而促进病毒增殖。栗疫菌低毒病毒CHV4编码的蛋白p24通过抑制Cpdcl2的转录而抑制RNA沉默，并能够协助病毒MyRV2侵染，促进MyRV2的积累[27]。另有研究表明，SsHADV-1侵染抑制寄主RNA沉默后，激活了DNA复制和修复反应[20]。

表2 真菌病毒编码的RNA沉默抑制子Table 2 RNA silencing suppressores encoded by mycoviruses

2.3 影响寄主细胞信号通路

减弱植物真菌致病力的真菌病毒侵染会干扰寄主细胞信号转导途径。MAPK（Mitogen-activated protein kinase，促分裂原活化蛋白激酶）信号通路是生物体内重要的信号转导途径之一，通过磷酸化或去磷酸化将信号逐级传递。栗疫菌中分离到与MAPK途径有关的两个基因Cpmk1和Cpmk2，病毒CHV1-EP713通过上调Cpmk1基因的表达从而调控MAPK信号通路[31]，而Cpmk2基因的表达不受病毒影响[32]。钙离子在真核生物信号转导途径中起重要作用，Parsley等[33]发现CHV1-EP713能够抑制CpLac-1和CpLac-3基因的表达，影响IP3-Ca2+-钙调素-钙调蛋白信号传导途径，CHV1-Euro7只抑制CpLac-1基因的表达。

G蛋白在丝状真菌中参与营养代谢、信息素反应和营养不亲和等过程[34]。Gao等[21]发现SsNSRV-1 ORF I的表达会影响G蛋白偶联受体介导的信号转导途径。在突变株Z1-1和Z1-13中与G蛋白信号转导相关的4个基因存在差异表达。Choi等[35]发现在CHV1侵染菌株中CpG-1基因的表达量减少，说明病毒通过抑制G蛋白同源基因CpG-1的表达从而干扰寄主 G蛋白偶联受体介导的信号转导途径。Ding等[36]发现病毒SsHADV-1可能首先突破真菌细胞壁，并与细胞膜相关小G蛋白相互作用传递信号，将信号传递到细胞核等各种亚细胞结构中，破坏细胞的生物合成。Wu等[37]发现在SsMYRV4侵染的菌株与其他营养不亲和菌株发生融合时，G蛋白亚基Gα、Gβ和Gγ的表达被抑制，营养不亲和相关基因的表达也被降低，表明病毒能够影响细胞内G蛋白偶联受体所介导的细胞信号通路，降低菌丝的营养不亲和反应。

2.4 影响寄主真菌次生代谢产物生物合成途径

次生代谢产物是植物、动物和微生物进行抗病和生存竞争的关键分子，其种类繁多，产生的时间和部位通常也具有条件诱导性。禾谷镰孢菌侵染小麦引起赤霉病，会产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）等毒素，这些毒素会直接危害宿主细胞，为病菌生长产生更有利的基质条件。Li等[15]发现低毒病毒FgHV2侵染禾谷镰孢菌后能够降低病原体DON的积累，表明FgHV2抑制了寄主毒素的产生，从而进一步降低禾谷镰孢菌的致病性。Qu等[38]通过转录组测序发现当SsHADV-1侵染DT-8菌株后，毒力相关基因下调表达。低毒病毒CHV1侵染板栗疫病菌后菌株色素分泌减少，致病力显著降低。Wang等[39]通过双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）和差异蛋白质组学质谱定量（isobaric Tagging for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技术发现 CHV1侵染板栗疫菌下调漆酶代谢合成相关基因Cplaccase3和CplaccaseA基因的表达，表明CHV1可能通过调控漆酶的合成进一步降低板栗疫病菌的致病力。

3 真菌病毒在病害防控中的应用

3.1 通过减弱病原真菌致病性防治植物病害

首次用于防治植物真菌病害的低毒病毒是CHV1[40]，该病毒在20世纪90年代欧洲栗疫病流行期对栗疫病的防治取得显著的成效，挽救了大批濒临灭绝的欧洲栗树林。2012年，张林巧等[41]通过田间试验表明，在人工接种CHV1两年后，CHV1-CN280在田间成功定殖，并扩散到田间栗疫菌菌株中。2017年，Krstin等[42]发现CHV1侵染的菌株CR23和M56/1都有致病力减弱的现象，可以作为潜在的生物防治剂。2019年，Xiong等[43]通过表达CHV1-CN280的蛋白p29，发现其转化子可以在栗疫菌和稻瘟病菌中表达，并能抑制色素产生、减少分生孢子产量，具有非常好的生物防治潜力。

2013年Yu等[9]提取SsHADV-1病毒粒子，发现这些粒子可直接侵染无毒的核盘菌菌丝，喷洒在植物叶片上能够抑制菌斑扩散。Yu等[44]在大田环境下进行试验，发现病毒粒子在叶片上可存活15 d，且能够降低病害发病率和病情指数。虽然SsHADV-1病毒粒子只可以侵染小核盘菌Sclerotinia minor3-4-1菌株和雪腐核盘菌Sclerotinia nivalisLet-19菌株，寄主范围窄，但施用时靶向性高，安全性好，同时为更多真菌病毒产品的开发提供了新的模式。

2018年，Mochama等[45]发现核盘菌DK3菌株的dicer1/2双敲除突变株生长慢，在SsHV2-L、SsHADV-1共同侵染后表现出更严重的生长缓慢、色素沉着减少等表型变化。这种混合侵染减弱寄主致病性的现象为我们开辟了新的生物防治途径。另外，病毒侵染也可以增强寄主对环境的适应能力。吴松松等[46]发现病毒SsMYRV4侵染核盘菌可以增强核盘菌耐高渗能力和耐活性氧的能力。目前，低毒病毒的体外传播机制还不明确，研究有效的低毒病毒体外传播途径为病毒的传播提供有力的支持。低毒病毒侵染的寄主往往单一，因此分离鉴定更多能够减弱毒力又具有强侵染力的真菌病毒对生物防治具有重要意义。

3.2 通过诱导寄主真菌内生活性和提高植物免疫力防控植物真菌病害

近期研究发现，一些真菌病毒侵染可以将植物病原真菌转化为对植物有益的内生真菌。Zhang等[47]发现真菌病毒SsHADV-1侵染核盘菌DT-8后，能够抑制核盘菌关键致病基因的表达，调控油菜与防御、激素和昼夜节律通路有关基因的表达。田间试验表明，在开花期早期喷施 DT-8菌株可使油菜茎腐病减轻67.6%，增产14.9%。曲正等[48]利用携带SsHADV-1的核盘菌DT-8菌株菌丝悬液进行油菜种子处理，观察到核盘菌DT-8可以在油菜体内定殖并且有效地控制油菜菌核病，有效增加油菜产量。对地下部分进行分析发现微生物群体结构发生了改变，植物病原菌丰度降低，且植物对茎腐病的耐受性更强。这些研究结果表明，携带减弱寄主致病性病毒的病原真菌侵染植物后，致病性状基本丧失，反而能够诱导植物免疫，同时具有促进植物生长，提高产量的作用。

Tian等[49]对SsHADV-1侵染的核盘菌DT-8菌株、脱毒菌株和野生型菌株进行了不同寄主的侵染实验，发现核盘菌在油菜上是一种腐生菌，在小麦、水稻、大麦、玉米和其他谷类中则可以作为活体营养型内生定殖。DT-8菌株施用于小麦后，能够减轻 40%的由镰刀菌引起的病害危害，而且能够提高小麦产量。这些数据表明，一种植物的病原菌在另外一种植物上可以作为内生菌存在，真菌病毒的侵染能够降低病原菌传播的风险，提高内生菌施用的安全性，并且增强内生菌的功能活性。这种利用感侵染真菌病毒的菌株诱导植物免疫，开发病毒-真菌共生的植物疫苗，是真菌病害生物防治的一种新策略。真菌和病毒联合应用模式为植物疫苗的开发提供了新思路。

4 真毒病毒应用的前景与面临的问题

当前，真菌病害新型生防因子的挖掘与开发越来越受到关注。真毒病毒能够抑制病菌扩散，且不会对植物造成伤害，无农药残留，具有绿色、安全、可持续等优点，利用真毒病毒对植物真菌病害进行生物防治被认为是极具潜力的防治策略。

与动植物病毒相比，我们对真菌病毒的了解仍然不够深入。多数真菌病毒在其增殖周期中缺乏细胞外阶段，真菌菌株间普遍存在营养不亲和性，导致病毒传播困难。Choi等[50]通过比较基因组学筛选了栗疫菌营养不亲和（vegetative incompatibility，vic）相关的7个基因，发现vic2、vic6或vic7的破坏增强了病毒的传播。另外，研究表明，某些病毒能够突破寄主营养不亲和性进行侵染。Hamid等[51]报道真菌病毒SsDFV2可以克服寄主营养不亲和性，侵染核盘菌1980菌株，这是首次报道+ssRNA真菌病毒可以克服营养不亲和的限制，这一现象有助于真菌病毒在作物病害防治中更好的应用。吴松松等[36]发现携带SsMYRV4的菌株能够与营养不亲和菌丝进行融合。SsMYRV4及其寄主核盘菌可以作为病毒传播的“桥梁”，与SsDRV或SsMV1共侵染同一菌株时，SsMYRV4促进其它病毒在营养不亲和的不同个体间传播，带动病毒在核盘菌群体间的传播。SsMYRV4的这种特性为其他具有生防潜力、但受限于营养不亲和限制的RNA病毒的生物防治应用提供了可能。因此，探索发现能够突破菌株营养不亲和性的病毒及其模式机理是真菌病毒未来研究的重点之一。

近年来，伴随分子生物学技术手段的快速发展，真菌病毒研究发展很快。但真菌病毒的研究应用仍需要克服以下几个困难：一是真菌病毒的资源挖掘程度不够。目前已经利用高通量技术发现了大量的真菌病毒，但存在菌株覆盖面窄、病毒基因组序列不完整、病毒功能未知等短板，限制了真菌病毒资源发掘的全面性和完整性。二是病毒-真菌-植物互作机制研究较少。目前大部分的真菌病毒研究集中在资源挖掘和病毒鉴定水平，在病毒与寄主真菌互作以及病毒-真菌-植物三者互作机制方面研究较少。三是真菌病毒产品的商品化开发不足。市场上亟需基于真菌病毒的真菌病害生防产品，助力我国农业安全生产。我国科学家对 SsHADV-1等进行了病毒体外施用和病毒-寄主植物疫苗等两方面进行了深入研究，有望开发出新型植物病害生防产品。