含草甘膦抗性标记的水稻核不育繁殖系载体构建与验证

李焱瑶 邓力华 李昕晏 李华 秦冠男 翁绿水 于江辉 李锦江 肖国樱, 3,*

含草甘膦抗性标记的水稻核不育繁殖系载体构建与验证

李焱瑶1, 2邓力华1李昕晏1李华1秦冠男1翁绿水1于江辉1李锦江1肖国樱1, 3,*

(1中国科学院 亚热带农业生态研究所/亚热带农业生态过程重点实验室，长沙 410125；2中国科学院大学，北京 100049；3中国科学院 种子创新研究院, 北京 100101;*通信联系人, email: xiaoguoying@isa.ac.cn）

【目的】使用草甘膦抗性基因替代潮霉素抗性基因，构建核不育繁殖系的转化载体，赋予繁殖系对除草剂草甘膦的抗性，规避现行政策对转基因作物中使用抗生素标记基因的限制。【方法】利用同源重组的方法，构建含草甘膦抗性基因Epsps、花粉致死基因、核不育恢复基因和红色荧光基因的水稻核不育基因繁殖系载体pC3300-Epsps-AA-Eat-Red；采用农杆菌介导法转化水稻。【结果】通过转化籼稻品系9K19-5获得普通核不育繁殖系Eat9K的转化植株318个。表型鉴定表明，单拷贝转化体Eat9K-3的花粉有可育和不育2种类型，种子有具有和不具有荧光信号2种类型，具有荧光信号的种子在发芽期能耐受浓度至少为1 g/L的草甘膦。建立的四引物检测法能够区分野生型基因和核不育基因。【结论】证明载体pC3300-Epsps-AA-Eat-Red有效，创制了具有除草剂抗性的普通核不育繁殖系新种质，建立了区分野生型基因和核不育基因的四引物检测法。

草甘膦抗性；花粉致死；育性恢复；普通核不育繁殖系

“民以食为天”，粮食安全是关系到14亿人口大国的头等大事。我国粮食需求量大，受到资源和技术制约，粮食产量进一步增长的难度不断加大。受新冠肺炎疫情影响，全球粮食供应链出现波动。因此，自主保障口粮绝对安全的意义十分重大。

水稻是我国最重要的粮食作物之一。2021年我国水稻播种面积为2992.12万hm2，占全国粮食播种面积的25.44%，稻谷产量为21 284.3万t，占全国粮食产量的31.17%[1]。我国不仅耕地面积有限，而且工业化、城镇化还需继续占用更多耕地。因此，提升水稻单产是保障口粮安全的重要措施。

籼型三系杂交稻的创制和应用，打破了自花授粉作物不具有杂种优势的理论禁锢，大幅提高了产量，被誉为“第二次绿色革命”。1999年我国杂交水稻推广面积约1479万hm2，占水稻播种面积的50%～55%，杂交水稻单产比常规水稻提高20%～30%[2]。但是，三系法杂交稻仍存在局限性，其不育性由细胞核基因与细胞质基因共同控制，遗传背景单一，且不育涉及核质基因互作，机制相对复杂，选育不育系的效率低[3, 4]。受恢保关系限制，三系杂交水稻恢复系选育难度大，配组出综合性状优良的杂交组合几率小，且制种程序繁杂。

两系法杂交稻与三系法杂交稻相比，主要优势有：1）不育性仅由核基因控制，不受细胞质基因影响，没有细胞质负效应，不育系选育相对容易、遗传多样性高；2）不育系繁殖与常规稻繁殖基本相同，不需要异交制种过程，繁殖程序简单；3）没有恢保关系限制，同亚种的几乎全部品种均能恢复两系的核不育性，恢复系选育程序相对简单、遗传多样性高，选配出高产两系杂交稻组合的几率大。1996年两系杂交水稻推广面积占杂交水稻种植面积的0.92%，到2016年已经占杂交水稻推广面积的50%左右[5, 6]。20年间两系杂交稻面积扩大了50倍左右，并且推广面积呈进一步扩大的趋势。数据显示，2016年至2020年审定的两系杂交水稻品种超过了前20年审定的两系杂交水稻品种数量，多达1000个[5]。截至2021年，农业部冠名的超级稻品种135个，其中两系杂交稻42个，占31.1% (https://www.ricedata.cn/variety/superice.htm)。

但是，两系法杂交水稻也存在明显不足。由于水稻光温敏核不育系的育性受温度的影响，而自然界气温的变化具有不确定性，因此应用光温敏核不育系的两系法杂交稻制种存在一定风险[7]。普通隐性核不育败育彻底、稳定，不受温度和光照等环境因素影响，且其不育性大多由一对隐性核基因控制，绝大部分的常规水稻都具有使其育性恢复的野生型基因[3]。过去，由于普通隐性核不育没有保持系，不育性的保持要依靠不育基因纯合株与不育基因杂合株杂交，再从后代中分离出50%的不育株而实现。但是，其中50%不育株和50%可育株的判定要等到开花时才能完成，获得的不育株不具备商业化生产杂交种子的价值。1993年，比利时Plant Genetic System公司发明了种子生产技术(Seed production technology，SPT)[8]，即在普通隐性核雄性不育系中导入连锁表达的育性恢复基因、花粉致死基因和荧光蛋白基因，使50%的可育种子（繁殖系）具有荧光而50%的不育种子（不育系）没有荧光，从而通过荧光分选解决了普通隐性核雄性不育系种子的高效繁殖问题。第三代杂交水稻借鉴SPT技术，实现了水稻普通隐性核不育系的高效繁殖，避免了两系法杂交稻中不育性不稳定的问题[9]，具有广阔的应用前景。如应用SPT技术培育的第三代杂交水稻三优2号单季亩产达1085.99 kg[10]。

当前研究报道的水稻普通核不育系繁殖系的表达载体大多数是以潮霉素为筛选标记的双边界载体[11]，潮霉素筛选标记与三个连锁表达的目的基因在不同的T-DNA区域。这种双T-DNA边界载体存在两方面不足：一是需要获得潮霉素筛选标记与三个连锁表达的目的基因共转化的转基因植株；二是共转化的转基因植株需要经过后代分离、筛选才能获得不具有潮霉素筛选标记的普通核不育繁殖系。如果表达载体中潮霉素筛选标记与三个连锁表达的目的基因在同一个T-DNA区域，不分离，在现行农业转基因生物安全性评价政策下含有抗生素基因的转化体是不能通过安全性评价的。针对这些问题，我们用抗草甘膦基因Epsps代替潮霉素抗性基因，在同一个T-DNA区中构建含抗草甘膦基因Epsps花粉致死基因育性恢复基因与红色荧光蛋白基因的连锁表达载体，既规避了使用潮霉素抗性基因的政策限制，又避免了共转化时目标基因转化效率不高的缺点，同时还可以利用繁殖系的草甘膦抗性方便在后续不育系种子生产中除草和除杂。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

遗传转化受体为本课题组培育的高培养力籼型水稻品系9K19-5 (L. subsp)[12]。核不育基因供体为含核不育基因的第三代杂交稻，由湖南杂交水稻研究中心李新奇课题组提供。回交改造用轮回亲本为本课题组自选保持系科20B（湘鉴稻20220014）。

1.2 菌株与质粒

农杆菌EHA105 ()购自上海唯地生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α ()购自湖南擎科生物技术有限公司。质粒pC3300-UbiEpsps-35sCry1Ca由本课题组构建并保存[13]；质粒pC1300-Eat1由湖南杂交水稻研究中心李新奇课题组提供。

1.3 试剂与仪器

限制性内切酶和长链高保真酶（PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase）购自TaKaRa公司；In-fusion试剂（NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix）购自NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；2×M5 Master Mix购自北京聚合美生物科技有限公司；Southern专用DNA分子量标记购自北京天恩泽基因科技有限公司；地高辛检测试剂盒购自瑞士罗氏制药有限公司。

凝胶成像系统的型号为美国伯乐ChemiDoc XRS；正置荧光显微镜的型号为日本奥林巴斯BX51；植物活体成像系统的型号为美国Picarro,VILBER FUSION FX7.EDGE SPECTRA；荧光观察仪型号为美国LUYOR公司的LUYOR- 3415RG双波长荧光蛋白观测灯。

1.4 载体构建与转化

利用Ⅰ和Ⅰ双酶切质粒pC3300- UbiEpsps-35sCry1Ca后电泳分离得到线性化载体的大片段，利用高保真酶扩增质粒pC1300-Eat1中的花粉致死基因表达框，采用同源重组方法[14]构建载体pC3300-Epsps-AA。Ⅰ单酶切载体pC3300-Epsps-AA，利用高保真酶扩增质粒pC1300-Eat1中的育性恢复基因和红色荧光蛋白基因的表达框，利用同源重组方法构建植物表达载体pC3300-Epsps-AA-Eat-Red。水稻遗传转化参考王作平的方法[15]。

1.5 PCR鉴定与Southern检测

采用CTAB法提取水稻基因组DNA。用引物对Epsps-F/Epsps-R、ZmAA1-F/ZmAA1-R、LtpEat1-F/LtpEat1-R、DsRed2-F/DsRed2-R (表1)分别检测Epsps、、和基因。PCR扩增体系总体积10 µL，包括2×M5 Master Mix 5.0 µL、10 µmol L上下游引物各0.3 µL、DNA模板1.0 µL，补充ddH2O至10 μL。PCR扩增程序为94℃下预变性4 min，94℃下变性30 s，58℃下退火30 s，72℃下延伸（按1 kb /min设定时长），34个循环；最后72℃下延伸5 min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察、拍照。

使用引物对Epsps-F/Epsps-R和质粒pC3300- Epsps-AA-Eat-Red模板，采用PCR法制备地高辛标记的Epsps基因Southern杂交探针。基因组DNA经Ⅰ酶切。Southern杂交中电泳、转膜、杂交和检测等具体步骤参考邓力华的方法[13]。

表1 本研究用到的引物序列

1.6 花粉育性观察

取T2转基因水稻转化体Eat9K-3与对照9K19-5主穗颖花的花药置于载玻片上，加1～2滴1% I2-KI溶液染色后夹碎，用正置荧光显微镜观察。

1.7 种子荧光观察

收获成熟的转化体Eat9K-3种子，干燥之后用活体成像仪观察穗，用手持式LUYOR-3415RG双荧光蛋白观察灯分选水稻种子。

1.8 除草剂抗性鉴定

T2代单拷贝转化体Eat9K-3与对照9K19-5分别置于0.34 g/L与0 g/L草甘膦的生根培养基中发芽；3 d后将Eat9K-3萌芽的种子转入1.0 g/L草甘膦生根培养基上，将对照9K19-5萌芽的种子分别转入1.0 g/L与0 g/L草甘膦生根培养基上；一周后观察生长状态，用活体成像仪拍照。

1.9 回交转育

设计引物对Eat1af/Eat1br与Eat1bf/Eat1ar（表1），用于区分与基因。以Eat9K作为母本，含不育基因的第三代杂交稻作为父本进行杂交，聚合、Epsps、、和基因；然后用科20B作为轮回父本与它杂交，之后连续回交2～3代后自交。杂交或回交后代喷施除草剂草甘膦和分子标记筛选同时含、Epsps、、和基因的单株。

2 结果与分析

2.1 载体构建

构建完成的表达载体pC3300-Epsps-AA- Eat-Red约22 kb，其T-DNA区域约16 kb，T-DNA区域结构如图1-A所示。Ⅰ酶切将载体切成两条带，大小分别为15 368 bp和6 791 bp（图1-B）。载体pC3300-UbiEpsps-35sCry1Ca只能检测到Epsps基因，载体pC1300-Eat1只能检测到和基因，而载体pC3300-Epsps- AA-Eat-Red能检测到Epsps、、和这4个目的基因（图1-C）。Ⅰ酶切和PCR检测均证实载体构建成功。

A−载体pC3300-Epsps-AA-Eat-Red的T-DNA区域。Epsps#―草甘膦抗性基因；TNOS―来源于胭脂碱合成酶基因的终止子；PG47―来源于玉米多聚半乳糖醛酸酶基因的花粉特异性启动子；ZmAA1―玉米的α-淀粉酶基因，赋予花粉致死性的花粉致死基因；Tin2-1―来源于In2-1基因的终止子；PEat1―Eat1基因的启动子，Eat1在绒毡层表达，具有育性恢复作用；TEat1―Eat1基因的终止子；Ltp2―来源于大麦糊粉层的特异性启动子；DsRed2―来源于珊瑚的DsRed2基因，编码红色荧光蛋白；CaMV 35S polyA―花椰菜花叶病毒多聚腺苷酸化信号。B−质粒pC3300-Epsps-AA-Eat-Red酶切结果。M−DL 15000 DNA分子量标记；泳道1−完整质粒；泳道2−质粒经PacⅠ酶切。C−PCR检测载体中Epsps#、ZmAA1、Eat1和DsRed2基因。M−DL2000 DNA分子量标记；泳道1−检测pC3300-UbiEpsps-35sCry1Ca；泳道2−检测pC1300-Eat1；泳道3−检测pC3300-Epsps-AA-Eat-Red。

Fig. 1. T-DNA region of vector pC3300-Epsps-AA-Eat-Red and molecular identification.

2.2 转基因再生植株获得与分子鉴定

选干燥、疏松、淡黄色的愈伤组织用包含质粒pC3300-Epsps-AA-Eat-Red的农杆菌侵染，经愈伤组织筛选、分化，获得的再生植株命名为Eat9K。PCR扩增再生植株Eat9K基因组DNA，检测到与Epsps、、和基因对应的、大小分别为561 bp、1054 bp、562 bp和616 bp的目标条带（图2）。T1代共检测384丛再生植株，其中，阳性植株318株，阴性植株66株，部分检测结果如图2所示。结合T2代Southern杂交结果筛选出单拷贝转化体进行表型鉴定，部分T2代Eat9K转化体Ⅰ酶切的Southern检测结果如图3所示。

A―Epsps#基因检测；B―ZmAA1基因检测；C―Eat1基因检测；D―DsRed2基因检测。M―DL2000 DNA分子量标记；P―质粒pC3300-Epsps-AA-Eat-Red；CK―对照9K19-5；1～20―不同的Eat9K再生植株。

Fig. 2. PCR detection of regenerated Eat9K plant.

M―地高辛标记的DNA分子量标记；P―质粒pC3300-Epsps-AA- Eat-Red；CK―非转基因对照；3、6、12、15、17、23、24、28、35分别为Eat9K的不同转化株。

Fig. 3. Southern blotting ofEpspsgene in T2generation of Eat9K.

2.3 表型鉴定

2.3.1 花粉育性观察

Eat9K转基因植株中含花粉致死基因。该基因在花粉发育后期表达，使含有该基因的花粉失活。选择T2代中初步检测为单拷贝的转化体Eat9K-3进行花粉育性检测，可以观察到可育花粉和不育花粉，说明在花粉中表达（图4-A右边），其结实率为74.75%。而对照9K19-5为常规可育品种，花粉几乎全部为可育花粉粒（图4-A左边）。

A−花粉育性观察; B−种子荧光观察; C−除草剂耐受性观察。

Fig. 4. Phenotype identification of Eat9K-3.

2.3.2 种子荧光观察

Eat9K转基因植株中含红色荧光蛋白基因。该基因在水稻种子糊粉层中表达，种子具有红色荧光。检测Eat9K-3和对照9K19-5的种子，转化体Eat9K-3的种子具有红色荧光，而对照9K19-5的种子没有红色荧光（图4-B）。说明基因在Eat9K-3种子中已经表达。对Eat9K-3的红色荧光和没有荧光种子数量进行卡方检验，结果表明红色荧光种子和无荧光种子的比例符合1∶1（χ2<χ20.05,1，表2）。

2.3.3 除草剂耐受实验

Eat9K转基因植株中含抗草甘膦基因Epsps。该基因是遗传转化过程中的筛选标记，同时也是抗除草剂的目的基因，使成功转入该基因的植株具有草甘膦抗性。除草剂耐受试验表明，具有红色荧光信号的Eat9K-3种子在含1 g/L草甘膦的培养基上正常生长，表现出草甘膦抗性，而9K19-5的种子在含1 g/L草甘膦的培养基上死亡（图4-C）。

表2 Eat9K-3的有荧光种子与无荧光种子卡平方检验

2.4 回交转育

为了获得更多转基因植株和更好的转化事件，转化受体使用了高培养力的正常可育籼稻品系9K19-5。因此，转基因品系Eat9K-3的基因型为/,/－－－－，含有组成型表达的抗除草剂基因Epsps（简写为）、花粉特异表达的花粉致死基因（简写为）、绒毡层特异表达的野生型育性恢复基因（简写为）和胚乳特异表达的红色荧光蛋白基因（简写为），没有普通核不育基因。

测序结果显示，与9K19-5中的野生型基因相比，普通核不育基因有2个bp的碱基缺失（图5-A中红色标记碱基）。根据二者序列差异，设计了4条引物来区分和的基因，引物设计见图5-A。PCR检测时，野生型基因能够扩增出2条带，大小分别为450 bp和222 bp，突变基因也能扩增出2条带，大小分别为450 bp和269 bp，杂合基因型能够扩增出3条带，大小分别为450 bp、269 bp和222 bp (图5-B)。

将转基因品系Eat9K（因含花粉致死基因导致其花粉不育只能作母本）作为母本与含有基因的第三代杂交稻植株杂交，通过喷施草甘膦和种子荧光筛选挑选出具有转基因元件的后代，通过分子标记追踪基因，从含转基因元件的植株中筛选出含基因的杂合型单株（图5-B，基因型为/,/－－－－）。之后，以科20B为轮回亲本回交2～3次，在回交代中继续用除草剂处理和分子标记方法跟踪和筛选目标基因，然后自交就可以获得遗传背景稳定的普通核不育繁殖系Eat20E（基因型为,－－－－）。

3 讨论

第三代杂交稻繁殖系的表达载体一般是以潮霉素为筛选标记的双边界载体[11]，潮霉素筛选标记与3个连锁表达的目的基因在不同的T-DNA区域。这种双T-DNA边界载体存在两方面不足。一方面，经过潮霉素筛选获得的再生植株不一定都含有3个连锁表达的目的基因，需要二者共转化。假定潮霉素抗性基因转化效率为60%，3个连锁表达目的基因的转化效率为20%，那么共转化的效率理论上只有12%，获得的潮霉素抗性植株中大部分不含有所需要的3个连锁表达的目的基因，共转化效率低。另一方面，共转化的转基因植株需要经过至少1个世代的分离，才能从中筛选到不含有潮霉素筛选标记，含有3个连锁表达的目的基因的单株，花费的时间较长。本研究中用草甘膦抗性基因Epsps替换潮霉素抗性基因，构建了植物表达载体pC3300-Epsps-AA-Eat-Red，获得的转化体Eat9K不需要经过后代分离就可以进行下一步杂交改造，提高了育种效率。

A−Eat1和eat1基因测序结果与四引物设计。B−PCR检测Eat1和eat1基因。M−DL2000 DNA分子量标记；WT−受体品种9K19-5；eat1−eat1基因纯合的不育株；H−eat1基因杂合的第三代杂交稻单株；1～3−Eat9K-223杂交转育后的不同单株；4～10−Eat9K-242杂交转育后的不同单株；11−Eat9K-62杂交转育后的不同单株；12～17−Eat9K-150杂交转育后的不同单株；18～20−Eat9K-152杂交转育后的不同单株。

Fig. 5. Marker-assisted selection ofgene.

直播栽培是实现水稻生产过程高效的主要技术之一，而草害是造成直播稻的重要减产因素[16]。草甘膦是一种杀草高效、环境友好的除草剂，毒性低，容易被土壤中的微生物降解，对后茬作物的副作用小[17]。水稻普通核不育繁殖系具有草甘膦抗性，除了有利于普通核不育繁殖系的除草和方便直播外，还可以用苗期喷施除草剂的方法去除繁殖系中其他不抗除草剂品种的机械混杂，以及杀死生长在繁殖系大田中的前茬落粒谷，特别是杀死有些地区存在的、人工难以去除的杂草稻，提高不育系和繁殖系的纯度，保障转基因繁殖系的生态安全[18]。间接提高了第三代杂交稻种子的纯度，有利于第三代杂交稻的推广应用。

水稻的生态适应性较弱，长江中下游稻区的高产品种在华南、华北很难达到当地品种的平均产量。为了适应不同稻区生态环境，需要培育遗传背景多样化的普通核不育繁殖系。把传统的杂交育种技术和分子育种技术相结合，能够提高普通核不育繁殖系的选育效率。本研究培育的单拷贝转基因株系Eat9K-3（基因型为/，/－－－－）具有花粉致死系统，产生的可育花粉都不具有转基因元件。因此，在杂交和回交选育时，普通核不育繁殖系只能作为母本，性状优良的常规可育品种只能作父本（轮回亲本）。在选育的过程中，每一代都需要选择基因型为/e/－－－－的植株进行杂交、回交或自交。转基因元件可以通过相互紧密连锁的除草剂抗性基因，使用苗期喷施除草剂草甘膦的方法筛选获得，而与转基因元件自由分离的基因需要采用分子标记技术选择。如采用传统的表型选择技术筛选基因，隐性基因的表型需要自交一代后才能表现；杂交或回交与自交交替进行，降低了普通核不育繁殖系的选育速度和效率。本研究根据和基因的序列差别，建立四引物分子标记辅助选择法，一次PCR就能区分野生型（/）、杂合型（/）和突变型（/），简单、高效，将在普通核不育繁殖系的选育中发挥重要作用。图6以科20B为例，详细图示了利用本研究获得的普通核不育繁殖系Eat9K回交选育优良普通核不育繁殖系和不育系的育种程序。

图6 回交选育普通核不育繁殖系和不育系的育种程序

Fig. 6. Backcross breeding of common genic male sterile line and its multiplication line.

目前报道的第三代杂交水稻使用的普通核不育系最初是通过EMS诱变、辐射诱变或CRISPR/ Cas9基因编辑等方法获得的[9, 11, 19]。由于普通核不育植株不能自交繁殖种子，要么利用不育系的幼穗进行组织培养来繁殖不育植株，要么通过杂交-自交后分离出不育株来保持不育基因资源。Qi等[20]采用两个独立载体共转化玉米自交系的方法，一次性获得了普通核不育基因和普通核不育的恢复、筛选元件，提高了构建SPT系统的速度。其中一个为CRISPR/Cas9敲除载体，它负责敲除玉米育性基因为不育基因，另一个载体含有抗草铵膦基因、基因的CDS序列、花粉致死基因和红色荧光蛋白基因的表达框。两个载体共转化常规可育玉米品种，后代经过一次分离可以直接获得普通核不育系的繁殖系。水稻中也可以利用CRISPR/Cas9系统构建载体来敲除某个育性基因，同时构建含该育性恢复基因的CDS序列、花粉致死基因、红色荧光蛋白筛选标记基因、抗除草剂基因的连锁表达载体。理论上，两套载体共转化可以在任何遗传背景下得到性状优良，具有除草剂抗性的普通核不育繁殖系。这种“一步法”构建普通核不育繁殖系的方法与杂交转育一样，能够提高普通核不育繁殖系的遗传多样性，丰富其种质资源。不同的是，它能避免杂交转育所带来的连锁累赘。当然，在现行农业转基因生物安全评价制度下，每一个转化事件都要经过安全评价才能应用于生产，而用已经获得安全证书的转化事件进行杂交回交转育时，衍生系可以继承其安全评价结果，不需要再重复漫长的安全评价过程。从这个角度看，杂交回交转育速度更快。预计今后的转基因育种、SPT系统建立主要会采用杂交回交育种模式。

关于第三代杂交稻不育系和繁殖系的标识符号问题，袁隆平先生在2019年11月3日的第三代杂交稻测产会上指出，不育系沿用核不育基因的后缀S，繁殖系加后缀E，取Genetic engineering中工程的意思。保持系是指能与不育系杂交产生100%不育株的品系。SPT技术中生产不育系的转基因亲本一般不具备100%保持不育性的能力，因此称为普通核不育系的保持系不恰当。当前，第三代杂交稻还没有品种通过审定，标识也比较混乱，在此披露袁隆平先生的看法对于规范行业标识具有积极意义，也是对他老人家的最好纪念。

本研究验证了载体pC3300-Epsps-AA-Eat-Red的有效性，创制出了具有草甘膦抗性的水稻普通核不育繁殖系新种质Eat9K，建立了区分和基因的四引物分子标记检测法，为今后利用普通核不育基因进行第三代杂交稻育种提供了新的种质资源和可靠的分子标记辅助选择方法。

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Construction and Verification of Vector Containing Glyphosate Resistance Selection Marker for Multiplication of Common Genic Male Sterile Lines in Rice

LI Yanyao1, 2, DENG Lihua1, LI Xinyan1, LI Hua1, QIN Guannan1, WENG Lüshui1, YU Jianghui1, LI Jinjiang1, XIAO Guoying1, 3,*

(1Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;2University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3Innovation Academy for Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China；*Corresponding author, email: xiaoguoying@isa.ac.cn)

【Objective】 The hygromycin resistance gene is often used as a selection marker in expression vectors for multiplication of common genic male sterile (CGMS) lines in rice. The glyphosate resistance gene replaces the hygromycin resistance gene as it not only gives the multiplication line glyphosate resistance, but also bypasses the current policy restrictions on the use of antibiotic marker genes in genetically modified crops. 【Methods】An expression vector pC3300-Epsps-AA-Eat-Red was constructed by using homologous recombination method in order to multiply the rice CGMS line withmutation gene, which harbors the glyphosate resistance geneEpsps, pollen lethal gene, CGMS restorer geneand red fluorescent gene.-mediated transformation method was adopted. 【Results】 Transformation ofrice line 9K19-5 produced 318 regenerated plants of the CGMSmultiplication line Eat9K that could restore the sterility ofand resist glyphosate. The phenotype identification of single copy transformant Eat9K-3 showed that: there were two kinds of pollens in anthers, one was fertile and the other was sterile; the seeds included two types, one was with fluorescence and the other was without fluorescence; the seedlings from fluorescent seeds tolerated at least 1 g/L glyphosate. In addition, this study established a four-primer detection method to distinguish the wild-type genefrom the genic male sterile gene. 【Conclusion】 This study not only verified the effectiveness of the expression vector, but also created the new germplasm of CGMS multiplication line with herbicide resistance, as well as established a four-primer detection method to distinguish the wild-type genefrom genic male sterile gene.

glyphosate resistance; pollen lethality; sterility recovery; common genic male sterile multiplication line

10.16819/j.1001-7216.2022.211226

2021-12-26；

2022-02-25。

湖南省科技创新计划种业创新项目（2021NK1012）。