不同清洗方式对ZOE水门汀污染车针清洗效果的研究

叶 莺，徐晶洁，李 瑾，鲍文丽，祁 文，江 飞,

口腔医疗器械清洗、消毒、灭菌在口腔临床具有非常重要的意义，是预防传染病在口腔医生、工作人员和患者之间的传播主要手段之一[1]。由于口腔科器械种类众多、体积小、结构复杂、表面形貌凹槽和扭曲多，而口腔内微生物种类众多、充填和修复材料多样、分泌物(血液、唾液等)复杂，使用后的口腔器械可能被这些含有感染性物质的组织、材料污染。常规机械和化学清洁都相当困难[2]。即使目前在口腔临床中已有许多不同的清洗工具的方法，包括手工清洗、超声波清洗机和清洗消毒机，但仍可能有大量口腔材料和生物碎片残留在器械表面。潜在的感染物质可以从被感染的个体传染给其他患者[3]。目前清洗消毒流程处理口腔医疗小器械效果尚存争议。

氧化锌丁香酚(zinc oxide eugenol, ZOE)水门汀，由氧化锌(质量分数70%)和松香组成的粉末部分与丁香酚液体部分调合制成，能提供很好的密封效果，且丁香酚本身具有杀菌作用。被应用于临时性修复体黏结、龋源性可复性牙髓炎安抚治疗、根管治疗封药等治疗[4-7]。但该水门汀的固化、密封性能也给临床上清洗牙体组织、口腔器械上的剩余ZOE水门汀材料带来难度[8]。清除口腔金属表面ZOE水门汀材料的方法包括：蒸汽清洗、超声清洗和有机溶剂溶解，但步骤繁琐，不适用于临床处理大量口腔小器械的集中处理[9]。

本研究旨在优化临床上口腔器械上残留ZOE水门汀的清洗方法。以常用的金刚砂车针(TR-13)为例，表面负载Caviton亲水ZOE水门汀暂封材，在清洗流程中应用丁香酚液体溶解器械表面固化的ZOE水门汀材料。所得结果从金刚砂车针上ZOE水门汀残留称重、表面清洁度方面，与目前《口腔器械消毒灭菌技术规范》中规定口腔器械、器具和物品的清洗操作方法所得结果进行比较。为有效清洗口腔器械表面ZOE水门汀提供可行方案。由于我国目前公立口腔医疗机构日常门诊量大，所使用的一般流程是在门诊先收集、放置，再集中送消毒。因此，我们在本研究中验证了丁香酚清洗对集中放置器械是否具有抑菌作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

全能强效多酶清洗液(3M，美国)、医用泡沫保湿清洗剂预处理型(Cinma，美国)、丁香酚(常熟尚齿齿科材料有限公司，中国)、金刚砂车针(TR-13，Mani，日本)、Caviton亲水ZOE水门汀(GC，日本)、PBS缓冲液(Biosharp，中国)、氯化钠(沪试、中国)、琼脂、胰蛋胨、酵母提取物(均购自Oxoid，美国)。

1.2 实验器械

超声波清洗机(德瑞，中国)、电子天平(精度0.1 mg，华潮高科，上海)、优玛医用干燥柜(优玛，中国)、洁净工作台(苏净泰安，中国)、恒温培养箱(Shellab，美国)、离心机(Thermo，美国)、恒温振荡器(旻泉仪器，中国)、高压蒸汽灭菌器(致微，美国)、微孔板分光光度计(Spectramax，美国)、细菌浊度计(昕锐，中国)、SBC-12离子溅射仪(中科科仪，中国)、Phenom LE场发射扫描电镜(Phenom-World公司，荷兰)。

1.3 实验分组

取全新的金刚砂车针，分为9组，每组10支。A～E组进行ZOE水门汀清洗实验，E′、F、G、H组进行抑菌实验。具体分组及操作见表1。

表1 实验分组及样品处理

1.4 样品预处理

1.4.1 ZOE水门汀污染样品制备 A～E组金刚砂车针直接在工作端均匀涂布一层Caviton亲水ZOE水门汀暂封材料，晾干备用。E′、F组在菌液污染后涂布。

1.4.2 菌液污染样品制备 接种环取少量金黄色葡萄球菌，涂抹于LB琼脂培养板上，置于37 ℃恒温箱中培养，24 h后可用。选取菌落置于1.5 mL EP管中，PBS缓冲液吹打混匀，4 000 r/min离心5 min后弃上清，重复一次后，用LB培养基重悬至1×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌备用。E′、F、H组车针置于菌液中浸泡30 min后备用。

1.5 实验步骤

1.5.1 水门汀清洗实验 A组浸泡于清水中，B组浸泡于1∶200 3M全能强效多酶清洗液中，C组浸泡于医用泡沫保湿清洗剂，D组浸泡于丁香酚液体中。每组各浸泡30 min后捞出，按编号放置于医用小器械清洗盒中，流水冲洗后，放入1∶200配制的3M全能强效多酶清洗液超声清洗5 min。为节省清洗时间，设置E组为直接丁香酚超声清洗5 min。完成清洗后，干燥，电子天平称重。

1.5.2 抑菌实验 E′组车针预处理后丁香酚超声清洗5 min；F组车针预处理后丁香酚超声清洗5 min，多酶清洗液浸泡30 min；G为阴性对照组，不进行预处理及清洗浸泡；H为阳性对照组，浸泡菌液30 min。将E′、F、G、H组的车针分别以无菌生理盐水冲洗3 s后置于含1 mL LB培养液的1.5 mL EP管中，于37 ℃、200 r/min的恒温振荡器中摇菌6、24 h。每管取100 μL菌液置于96孔板中，用微孔板分光光度计测定在600 nm处的光密度D[10-11]，通过分析细菌浑浊度检验多酶清洗液抑菌作用。

1.5.3 扫描电镜检测 各组车针经过固定、脱水后使用SBC-12离子溅射仪进行喷金处理。Phenom LE场发射扫描电镜采用10 kV高电压、低束流、二次电子模式进行表面扫描，选取车针工作段中1/3处扫描拍摄。

1.6 统计方法

应用SPSS 18.0和GraphPad Prism7.0软件对数据进行统计分析和作图，定量资料以均数±标准差表示，各实验组数据差异分析采用单因素方差分析和两两比较进行评价。

2 结 果

2.1 不同清洗剂浸泡再经多酶清洗液超声清洗效果

金刚砂车针原始质量、负载ZOE水门汀后的车针质量结果如表2所示：各组车针质量、表面负载的ZOE水门汀无差异。

表2 各实验组车针及ZOE称重结果及清除率

在肉眼观察各组车针清洗效果，可明显看出A、B、C组仍残留大量ZOE水门汀，经过丁香酚浸泡的D组车针表面的ZOE水门汀清除得较为干净(图1)。

在扫描电镜下观察：A组车针表面，未见明显的ZOE水门汀脱落，车针金刚砂粒之间嵌满致密的ZOE水门汀，大部分金刚砂粒被覆盖；B组虽然在车针表面仍存在大量ZOE水门汀，但在电镜下显示ZOE水门汀结构疏松，并且有少量脱落；C组表面ZOE水门汀脱落区域增大，脱落的斑块较为明显；D组车针表面未见明显的ZOE水门汀，高光亮点区域为车针表面的金刚砂，金刚砂颗粒明显，车针表面未见明显ZOE水门汀覆盖(图1)。

黄色虚线标注区域a为ZOE水门汀脱落区域，红色虚线标注区域b为TR-13车针表面的金刚砂颗粒

统计使用单因素方差分析

电镜观察后对每组车针进行称重，与负载ZOE水门汀后车针的质量对比，如表2所示：D组的ZOE水门汀清除率明显高于其余三组；而A、B、C组ZOE水门汀清除率无明显差异。清洗后车针质量与清洗后质量相比，D组车针表面ZOE水门汀残留显著少于其他组。

2.2 丁香酚浸泡后多酶清洗液超声清洗与丁香酚超声清洗ZOE水门汀效果比较

虽然丁香酚浸泡后，车针表面ZOE水门汀已大部松解、剥脱，但仍会有部分残留。考虑超声清洗会显著提高清洗效率，因此，本研究尝试直接采用丁香酚对负载ZOE水门汀的车针进行清洗。如图1所示：D组为丁香酚浸泡30 min后多酶超声清洗5 min，E组为丁香酚直接超声清洗5 min，大体照片中未见清洗效果差异。再次对两组车针进行称重，结果所示：D、E两组车针表面ZOE水门汀残余质量(P=0.162 3)和清除率(P=0.168 1)无差异。因此，直接用丁香酚超声清洗器械表面ZOE水门汀可大大缩短椅旁预处理时间。

2.3 丁香酚抑菌效果

在电镜下观察如图2A所示，全新金刚砂车针(阴性对照G组)上未见有菌。金黄色葡萄球菌液浸泡的车针(阳性对照H组)上吸附大量细菌，划红色线区域为菌落部分。通过丁香酚超声清洗后，车针表面仅存在少量细菌。经过6 h摇菌培养，阳性对照组中浑浊度已有明显增加(图3，P<0.01)。而丁香酚超声清洗后的实验组中无明显变化；直到摇菌培养24 h后，LB培养液明显浑浊，说明已有较多细菌扩增(P<0.05)。因此，我们尝试在丁香酚超声清洗后配合使用多酶清洗液，观察是否可以有较好的抑菌效果(各实验组与阴性对照组相比)，结果如图3显示：丁香酚超声清洗后，经多酶浸泡(F组)可明显抑制细菌增殖。

图2 不同处理组抑菌效果(扫描电镜)

*:P<0.05；**：P<0.01

3 讨 论

根据国家颁布的WS 310-2016《医院消毒供应中心规范》[12]和WS 506-2016《口腔器械消毒灭菌技术规范》[9]的相关细则要求，对于结构复杂不易清洗的口腔器械(如口腔小器械、刮匙等)：①宜保湿放置，保湿液可选择应用饮用水或酶类清洗剂；②使用专用超声网篮超声清洗；③要达到灭菌水平。目前，我院对于车针、锉针等口腔小器械使用后，在椅旁阶段，采用多酶清洗液浸泡后送供应室集中处理；当车针器械进入供应室后，再次用多酶溶液并配合超声设备进行清洗；之后清水漂洗，进行煮沸预消毒；预消毒处理后对器械进行干燥并打包，最后使用高温蒸汽灭菌。经过这些流程，对于器械表面的活性微生物已可以达到灭菌效果。但由于没有针对ZOE水门汀材料的专门清洗流程，因此，临床中依然经常肉眼可见ZOE水门汀材料附着在口腔小器械表面。我们针对这一现状，在本研究中应用临床广泛使用的成品Caviton亲水ZOE水门汀暂封材污染粗糙表面的口腔小器械，希望通过清洗流程上的优化，来解决这一问题。因为ZOE水门汀在器械表面有黏结性，清理不净对灭菌后的口腔器械再次使用时虽无微生物来源的危害，但会降低器械在后续使用中的切削效率；另一方面，再次使用过程中先前黏附在器械上的材料碎屑还可能再次剥脱[13]。因此，我们需要对目前的口腔小器械清洗流程进行优化。

对照上述规范中要求口腔小器械回收后在椅旁保湿的原则和方法，我们在实验分组中设置了对车针进行清水浸泡、多酶浸泡的实验组。因为ZOE水门汀有遇水加速凝固的性能[6]，显然清水浸泡不利于溶解器械表面的ZOE水门汀。本研究通过对清水浸泡后车针表面进行扫描电镜观察和残留物称重，证实清水浸泡后金刚砂车针表面依然残留大量ZOE水门汀。关于酶类清洗液，目前有单酶类和多酶类清洗液[14]。单酶类清洗液主要是蛋白酶，只能分解蛋白污物。多酶清洗液中主要包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等，能更全面地分解清除医疗器械上的活性污染物[15]。目前我院使用的多酶溶液是全能强效多酶清洗液，其中包含了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、表面活性液等成分。虽然这两个实验组车针称重结果中多酶浸泡处理后的残余重量(17.7±4.1)mg和清除率(50.83±17.16)%与清水浸泡处理组无明显差别，但电镜下能观察到多酶浸泡后ZOE水门汀已有明显的脱落(图1中黄色虚线区域)，且ZOE水门汀表面出现多孔，质地明显更松散。类似的结果也可在保湿剂浸泡组观察到。Cinma医用保湿清洗剂中同样含有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及碳水化合物分解酶和表面活性剂。多酶浸泡组、保湿剂浸泡组对ZOE清理效果似乎与多酶中的酶成分关系不大，而得益于清洗液中的表面活性剂。而经过丁香酚浸泡的实验组不论从肉眼观察，还是电镜观察，车针表面的ZOE水门汀已基本清除(残余重量仅为(1.3±0.9)mg，清除率高达(95.06±3.69)%)。该结果说明：丁香酚也是ZOE水门汀的有效溶剂，以丁香酚浸泡表面黏有ZOE水门汀的处理是合理且有效的。本研究中仅用丁香酚浸泡30 min即可达到该清除效果，省时且并未增加门诊椅旁护理过多负担。丁香酚是口腔材料调配中的常用的液体溶剂，除ZOE水门汀外，还用于调制根管糊剂[16]。本研究应用丁香酚清洗ZOE水门汀后，经过流水冲洗、多酶浸泡，以及后续口腔器械常规清洗、消毒流程，本身丁香酚也具有挥发性，因此，清洗后未见器械表面有残留。另一方面，丁香酚的安全性方面也有文献报道：丁香酚对于不同物种细胞肽的亲和力不同，其中哺乳动物细胞的亲和力较差，这也证明其对人体细胞也具有较好的安全性[17]。即便器械表面有很微量的残留，在口腔外用操作中，也不会有生物安全性方面的风险。

目前在口腔器械消毒流程方面已有团队提出“处理提前”[18]。临床针对不同种类、不同污染源的器械进行针对性预处理，有利于提高后期供应室集中处理的效率[19-20]。对口腔临床大量使用后的污染的口腔小器械进行预处理，更有必要。上述讨论中，虽然丁香酚浸泡30 min，再行多酶超声5 min已能基本清除表面黏附的ZOE水门汀，但根据规范中的提示在“椅旁预处理”中加入超声清洗，是否使得对ZOE水门汀的清理更快更简便？因此，本研究比较丁香酚浸泡+多酶超声清洗与直接丁香酚超声清洗对清除口腔小器械表面ZOE水门汀的效果。结果意外地发现：直接将黏满ZOE水门汀的TR-13车针置于丁香酚溶液中超声5 min，与先丁香酚浸泡、再用多酶清洗液超声清洗结果无明显差异(P=0.162 3)。因此，在椅旁预处理时预备丁香酚溶液，将所收集的黏有ZOE水门汀的口腔小器械进行5 min超声，即可解决目前消毒流程中无法有效清理口腔小器械表面残留ZOE水门汀的问题。

上述实验结果已说明使用丁香酚液超声清洗含有ZOE水门汀的表面粗糙小器械能够获得很好效果。目前公立口腔医疗机构日常门诊大，难以做到每位患者诊疗后的器械逐一、立即送供应室消毒。一般在门诊先收集、放置，再集中送消毒流程。这就意味着门诊集中放置时可能存在病原微生物滋生。目前临床消毒清洗流程中所使用的多酶清洗液本身对病原微生物、蛋白质等感染性物质有灭活作用[14]。虽然在清除ZOE水门汀方面没有明显优势，但是否需要在丁香酚超声去除ZOE水门汀后再次应用多酶清洗液来应对门诊集中放置时可能存在的病原微生物滋生问题？本研究将消毒灭菌研究中常用的金黄色葡萄球菌[21-23]掺入ZOE水门汀，模拟口内去除ZOE水门汀时口腔内微生物与ZOE水门汀混合，观察丁香酚超声清除TR-13车针表面ZOE后，金黄色葡萄球菌的增殖情况。结果显示单纯使用丁香酚超声清除表面ZOE水门汀后，TR-13车针表面依然有散在的金黄色葡萄球菌(图2)，单纯丁香酚超声清洗的实验组和丁香酚超声清洗+多酶浸泡处理的实验组，经过6 h细菌培养，均未见明显细菌增殖。经过24 h的细菌培养后单纯丁香酚超声清洗的实验组中金黄色葡萄球菌有轻微扩增。这一结果也与已有报道中所提及丁香酚具有抑菌作用相印证[24-25]，而追加多酶浸泡处理后的实验组中抑菌效果更优于单纯使用丁香酚超声清洗的实验组(图3)。说明在应用丁香酚清除ZOE水门汀污染的粗糙小器械后，配合使用多酶浸泡处理，可获得更好的抑菌效果。因此，我们提出直接用丁香酚超声清洗粗糙器械表面的ZOE水门汀，可以明显缩短椅旁预处理的时间，但在集中存放门诊使用后器械的环节中需应用多酶浸泡预处理后的器械，有效抑菌，防止在集中存放时发生二次污染。

4 结 论

针对口腔临床粗糙表面的口腔小器械上难以清洗ZOE水门汀的问题，在椅旁应用丁香酚超声清洗，即可有效清除粗糙器械表面ZOE水门汀。但如果需要在集中消毒前暂时存放，则需要在丁香酚超声清洗后，用多酶消毒剂浸泡保存，防止病原微生物的滋生造成二次污染。本研究所述对ZOE水门汀污染器械行椅旁消毒预处理，对口腔小器械上ZOE水门汀清除效果好，且方法简便易行。