玉米ZmICS1和ZmSARD1的原核表达及多克隆抗体制备

上官晓庆，张春霞，赵天永

(西北农林科技大学 生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100)

水杨酸(salicylic acid，SA)是植物抵抗细菌、真菌、病毒，诱导防御相关基因表达，建立局部和系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)所必需的一种防御激素[1-3]。拟南芥90%防御相关的SA来源于异分支酸途径[4-5]。作为异分支酸途径的限速酶，异分支酸合成酶1(isochorismate synthase 1，ICS1)是一个定位于质体的基质蛋白，负责催化分支酸转化为异分支酸，在免疫反应中起重要作用[6]。拟南芥ICS1(sid2)突变后，内源SA含量显著降低，感染部位及远端叶片的免疫反应受到抑制，植株对白粉病菌和丁香假单胞杆菌敏感[5]。低温处理可通过水杨酸依赖途径激活拟南芥的抗病性[7]。16 ℃时野生型病原体的生长量较22 ℃明显减少，出现了抗病性增强的表型，而在SA突变体pad4和ICS1突变体sid2中，则未表现出低温增强植物免疫力的现象[8]。ICS1也在非生物胁迫中发挥一定作用。在大麦中过表达HvICS1，植株的耐旱性增强，具体表现为内源ABA含量及抗氧化酶活力升高[9]。同样，大麦HvICS1过表达植株也由于根系钠、钾离子通量增加及抗氧化酶活性升高表现出更强的耐盐性[10]。但也有研究表明，在高温和干旱的共同作用下sid2反而呈现出抗逆性增强的表型，这可能是由于sid2植株在高温和干旱条件下可通过维持光合、关闭气孔和积累可溶性糖来阻止水分的过量流失[11]。

SAR 缺陷1(SAR deficient 1，SARD1)是植物防御反应的主要调节因子。在病原菌侵染时，拟南芥SARD1受诱导合成后结合到ICS1启动子区激活ICS1转录，启动局部抗性[12]。同时，SARD1还调控SAR移动信号(N-hydroxypipecolic acid，NHP)的合成， NHP可在叶片中积累以抵御局部微生物侵染，并诱导远端叶片SAR反应，从而抵御多种病原菌[13]。研究表明，敲除SARD1会降低基础抗性及系统获得性抗性，过表达SARD1则会积累更多SA，激活防御反应[1]。

为研究ICS1和SARD1在玉米中的生物学功能，本研究对ZmICS1、ZmSARD1进行诱导表达，以His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白为抗原，分别制备ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗体，并检测玉米过表达ZmICS1、ZmSARD1原生质体中ZmICS1、ZmSARD1蛋白的表达水平，验证抗体特异性，以期为玉米抵抗生物胁迫机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株、载体及动物 三叶期B73叶片cDNA、大肠杆菌克隆菌株2984和表达菌株Rosett-gami2(DE3)、原核表达载体pET-28a和真核表达载体pTF101.1-ZmICS1、pTF101.1-ZmSARD1、pTF101.1-GFP，均为本实验室保存。制备抗体所用家兔由西北农林科技大学动物饲养场提供。

1.1.2 试 剂 Phanta Max高保真DNA聚合酶、TaqDNA 聚合酶、胶回收试剂盒、限制性内切酶、蛋白免疫印迹化学发光试剂盒(ELC)及HRP标记的羊抗兔抗体IgG，均购自康为世纪生物科技有限公司；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵及四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine，TEMED)，均购自Biotopped；透析袋MD25(YA1071)，购自Solarbio。

1.1.3 主要溶液 (1)磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS，pH 7.4)：磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44 g，氯化钠(NaCl)8 g，氯化钾(KCl)0.2 g，加蒸馏水约800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1 L。

(2)0.25 mol/L KCl：称取18.6 g KCl，加蒸馏水溶解并定容到1 L，4 ℃保存。

(3)5×Tris-Gly：称取15.1 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，94 g甘氨酸(Gly)，5 g十二烷基硫酸钠(SDS)，以800 mL蒸馏水溶解，最后定容至1 L。室温保存，用前稀释为1×Tris-Gly。

(4)转移缓冲液：称取Tris-base 5.8 g，Gly 2.9 g，SDS 0.37 g，以600 mL水溶解，溶解后加入200 mL无水乙醇，蒸馏水定容至1 L。

(5)TBST(TBS+Tween)：首先配制10×Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)，12.1 g Tris-base，40 g NaCl，以300 mL蒸馏水溶解，浓HCl调 pH至7.6，定容至500 mL。用前稀释为1×TBS，加入1‰～2‰ Tween-20，混匀即为TBST。

1.2 方 法

1.2.1 原核表达载体的构建 从NCBI搜索玉米ZmICS1及ZmSARD1的CDS序列，根据pET-28a载体多克隆位点分别设计克隆引物。引物序列为ZmICS1-F：5′-ATGGGTCGCGGATCCATGCCGC-CACCGTCTTCCTCGC-3′，ZmICS1-R：5′-TGCGGCCGCAAGCTTGATCACCGTTCCCAGATTT-TC-3′；ZmSARD1-F：5′-ATGGGTCGCGGATCCATGGCGGCGAAGCGTCTGTACAAC-3′和ZmSAR-D1-R：5′-TGCGGCCGCAAGCTTACCTGGCATGT-GGAACGCTTGG-3′(下划实线部分为BamH Ⅰ的酶切位点，下划虚线部分为Hind Ⅲ的酶切位点)。

以B73叶片cDNA为模板进行ZmICS1、ZmSARD1片段扩增，反应体系(50 μL)为：Phanta Max缓冲液(2×)25 μL、Phanta Max高保真DNA聚合酶1 μL、dNTP(10 mmol/L) 1 μL、50%二甲基亚砜4 μL、正反向引物(10 μmol/L)各2 μL、模板cDNA 3 μL、无菌双蒸水12 μL。 扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 30 s，循环35次；72 ℃延伸8 min。用1%琼脂糖凝胶检测PCR产物，割取目的条带并用胶回收试剂盒回收。再用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切pET-28a载体，使之线性化。随后将回收的目的片段与线性化的pET-28a载体于37 ℃连接30 min，连接产物用KCM法转化大肠杆菌2984感受态细胞，并挑取阳性菌落提取质粒进行酶切，验证片段与载体是否连接成功。最后将酶切验证正确的质粒分别命名为pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1,并送生工生物有限公司测序，测序正确后即可进行重组蛋白His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1的诱导表达。

1.2.2 重组蛋白的诱导及纯化 将原核表达载体pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1载体分别转化大肠杆菌Rosett-gami2(DE3)，分别挑取阳性克隆菌株至含50 mg/mL卡那霉素的30 mL LB液体培养基中，37 ℃，160 r/min培养5 h至OD600为0.6，然后加入0.84 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37 ℃，160 r/min诱导12 h。收集诱导前后的菌液并离心，用PBS重悬诱导前后的菌体，并用SDS-PAGE电泳检测蛋白是否诱导成功。

成功检测到诱导的目的蛋白后，以相同的条件大量诱导，收集诱导后菌液，在冰浴条件下超声破碎30 min(功率30%，工作3 s，休息4 s)后，4 ℃、12 000×g离心20 min，分别收集上清液和沉淀，用SDS-PAGE检测诱导前菌体及诱导后上清液和沉淀中目的蛋白的表达情况。对收集的诱导后蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，电泳结束后用预冷的0.25 mol/L KCl对胶进行负染，割取目标蛋白所在胶条，放入透析袋中，加入少量1×Tris-Gly，100 V电泳纯化2 h。将获得的纯化蛋白分别命名为His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1。用不同质量浓度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL)牛血清蛋白(BSA)检测纯化蛋白的质量浓度和纯度。

1.2.3 多克隆抗体的制备及验证 将纯化的His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白分别作为抗原，免疫4次家兔制备抗体(皮下注射6个点，脊椎两侧各3个点)。初次免疫抗原量200 μg/只兔子，抗原与完全弗氏佐剂按照1∶1体积比(500 μL蛋白+ 500 μL完全弗氏佐剂)混匀，振荡乳化2 h，对家兔脊椎两侧皮下多点注射。之后每隔2周加强免疫1次，抗原量为100 μg/只兔子；抗原与不完全弗氏佐剂按照1∶1体积比混匀，振荡乳化2 h，对家兔脊椎两侧皮下多点注射。4次免疫结束后7 d内抽取家兔心脏血，37 ℃静置1 h，凝血后4 ℃静置过夜，次日离心收集上清液(4 ℃，1 000×g离心5 min)，存于-20 ℃，每管分装200 μL。

将纯化的抗原分别进行梯度稀释，各取30，3，0.3 ng蛋白进行SDS-PAGE。电泳结束后按负极、海绵垫、滤纸2张、胶、PVDF膜、滤纸2张、海绵垫、正极的顺序放入装满转移缓冲液的电泳槽中进行转膜。转膜结束后取出PVDF膜，用50 g/L的封闭液(即0.5 g脱脂奶粉于10 mL TBST)室温封闭2 h后，用相应一抗Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1(将一抗与封闭液按照1∶5 000体积比稀释)孵育过夜， TBST洗膜3次，每次5 min，再用HRP标记的羊抗兔抗体IgG(稀释比例1∶20 000)孵育2 h，TBST洗膜3次，最后用化学发光试剂盒(ECL)处理后拍照观察。 用Image J对胶图进行灰度分析，确定His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1质量浓度。

1.2.4 多克隆抗体的检测 (1)玉米过表达原生质体的制备。PEG介导的玉米原生质体转化法参考Lei等[14]的方法。取10片三叶期B73叶片酶解，离心并洗脱，加1 mL MMg溶液(15 mmol/L MgCl2，质量分数0.1% MES，0.4 mol/L mannitol)重悬细胞，各取300 μL细胞重悬液分别转化pTF101.1-ZmICS1、pTF101.1-ZmSARD1和pTF101.1-GFP质粒30 μg，培养过夜后收取原生质体细胞，各加入40 μL蛋白提取液和10 μL 5×loading，沸水煮10 min,最终所得即为分别过表达ZmICS1和ZmSARD1及GFP的原生质体蛋白。

(2)Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1的蛋白免疫印迹检测。取纯化后的His×6-ZmICS1抗原、His×6-ZmSARD1抗原各3 ng，过表达GFP原生质体蛋白、过表达ZmICS1原生质体蛋白、过表达ZmSARD1原生质体蛋白各20 μg，按ZmICS1抗原、过表达GFP原生质体蛋白、过表达ZmICS1原生质体蛋白为一组；ZmSARD1抗原、过表达GFP原生质体蛋白、过表达ZmSARD1原生质体蛋白为一组进行SDS-PAGE电泳、蛋白免疫印迹检测。

2 结果与分析

2.1 pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1原核表达载体的构建

以B73 叶片cDNA为模板，PCR扩增ZmICS1和ZmSARD1 CDS区，如图1-A所示，ZmICS1 CDS区为1 689 bp，ZmSARD1 CDS区为1 314 bp，电泳结果与预测一致。

A.目的片段的扩增；B.重组质粒的酶切验证；M.DNA分子标记；1.ZmICS1片段PCR扩增结果；2.ZmSARD1片段PCR扩增结果； 3.经BamHⅠ、Hind Ⅲ双酶切的pET-28a-ZmICS1质粒；4.经BamHⅠ、Hind Ⅲ双酶切的pET-28a-ZmSARD1质粒 A.Amplification of target fragment;B.Enzyme digestion validation of recombinant plasmid;M.DNA molecular markers; 1.PCR amplification of ZmICS1 fragment;2.PCR amplification of ZmSARD1 fragment;3.Plasmid pET-28a-ZmICS1 digested by BamHⅠ and Hind Ⅲ;4.Plasmid pET-28a-ZmSARD1 digested by BamHⅠ and Hind Ⅲ图1 pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1原核表达载体的构建Fig.1 Construction of prokaryotic expression vectors pET-28a-ZmICS1 and pET-28a-ZmSARD1

将目的片段割胶回收后连接至pET-28a载体，用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切验证其是否连接成功。重组质粒pET-28a-ZmICS1双酶切产物应为1 689 bp的ZmICS1和5 343 bp的载体，pET-28a-ZmSARD1双酶切产物应为1 314 bp的ZmSARD1和5 343 bp的载体。如图1-B所示，酶切结果与预期一致，且测序正确，表明pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1原核表达载体构建成功。

2.2 重组蛋白的诱导及纯化

将原核表达载体pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1分别转入大肠杆菌Rosett-gami2(DE3)，37 ℃、0.84 mmol/L IPTG诱导蛋白12 h，取诱导前后菌液，通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达情况，结果如图2所示。在65 ku和50 ku分别有诱导表达的His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白，符合其理论大小，说明His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白诱导成功。

1.His×6-ZmICS1蛋白；2.His×6-ZmSARD1蛋白 M.蛋白分子标记；-.诱导前的全菌蛋白；+.诱导后的全菌蛋白 1.His×6-ZmICS1 protein;2.His×6-ZmSARD1 protein;M.Protein molecular markers;-.Whole mycoprotein before induction;+.Induced whole mycoprotein

将诱导后的菌体进行超声破碎，收集破碎后的上清液及沉淀，用SAD-PAGE检测蛋白的可溶性，结果(图3)表明，His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白均以包涵体的形式存在。

1.His×6-ZmICS1蛋白；2.His×6-ZmSARD1蛋白;M.蛋白分子 标记；-.诱导前的全菌蛋白；S.诱导破碎后的上清液； P.诱导破碎后的菌体沉淀 1. His×6-ZmICS1 protein;2.His×6-ZmSARD1 protein; M.Protein molecular markers;-.Whole mycoprotein before induction;S.Supernatant after induction and fragmentation; P.Precipitate after induction and fragmentation

SDS-PAGE电泳后割取目的蛋白所在胶条并于透析袋中透析纯化，以不同质量浓度BSA进行相对定量，检测纯化后目的蛋白质量浓度。经Image J 灰度分析可知，His×6-ZmICS1蛋白质量浓度为0.76mg/mL，His×6-ZmSARD1蛋白质量浓度为0.72 mg/mL，均达到免疫兔子所需质量浓度(≥0.4mg/mL)，可进行多克隆抗体制备(图4)。

M.蛋白分子标记；1.His×6-ZmICS1蛋白；2.His×6-ZmSARD1蛋白； 3～8.0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL BSA M.Protein molecular markers;1.His×6-ZmICS1 protein;2.His×6- ZmSARD1 protein;3-8.0.1，0.2,0.4,0.6,0.8 and 1.0 mg/mL BSA图4 His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1 纯化蛋白质量浓度的检测Fig.4 Mass concentrations of His×6-ZmICS1 and His×6-ZmSARD1 purified proteins

2.3 多克隆抗体的制备及验证

将纯化得到的His×6-ZmICS1和His×6-Zm-SARD1重组蛋白进行家兔免疫试验，收集免疫后血清。将纯化后的抗原His×6-ZmICS1、His×6-ZmSARD1进行梯度稀释(30，3，0.3 ng)，用制备的多克隆抗体1∶5 000稀释后进行蛋白免疫印迹检测。结果(图5)表明，多克隆抗体Anti-ZmICS1可检测到3 ng His×6-ZmICS1重组蛋白，Anti-ZmSARD1则能检测0.3 ng的His×6-ZmSARD1重组蛋白。

1～3.30，3，0.3 ng His×6-ZmICS1抗原；4～6.30，3，0.3 ng的His×6-ZmSARD1抗原 1-3.30,3,0.3 ng of His×6-ZmICS1 antigen;4-6.30,3,0.3 ng of His×6-ZmSARD1 antigen

2.4 多克隆抗体的检测

取3 ng纯化的抗原His×6-ZmICS1或His×6-ZmSARD1，20 μg过表达GFP原生质体蛋白，20 μg过表达ZmICS1或ZmSARD1原生质体蛋白，用多克隆抗体Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1分别进行免疫印迹检测，结果(图6)表明，Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1抗体1∶5 000稀释后可分别检测到3 ng的His×6-ZmICS1或His×6-ZmSARD1重组蛋白。过表达GFP的原生质体中能检测到少量内源ZmICS1和ZmSARD1蛋白，在过表达ZmICS1、ZmSARD1原生质体中分别能检测到ZmICS1蛋白(约62 ku)、ZmSARD1蛋白(约50 ku)大量积累，且蛋白大小均符合预期。说明多克隆抗体Anti-ZmICS1、Anti-ZmSARD1分别对玉米内源的ZmICS1、ZmSARD1蛋白有很好的特异性。

1.3 ng His×6-ZmICS1抗原；2，5.玉米叶肉原生质体中过表达GFP的总蛋白；3.玉米叶肉原生质体中过表达ZmICS1的总蛋白； 4.3 ng His×6-ZmSARD1抗原;6.玉米叶肉原生质体中过表达ZmSARD1的总蛋白 1.3 ng His×6-ZmICS1 antigen;2,5.Total protein of maize mesophyll protoplasm overexpressing GFP;3.Total protein of maize mesophyll protoplasm overexpressing ZmICS1;4.3 ng His×6-ZmSARD1 antigen;6.Total protein of maize mesophyll protoplasm overexpressing ZmSARD1图6 ZmICS1(A)和ZmSARD1(B)多克隆抗体的特异性检测Fig.6 Specific detection of ZmICS1(A) and ZmSARD1(B) proteins by Anti-ZmICS1 and Anti-ZmSARD1 polyclonal antibodies

3 讨 论

SA信号途径在双子叶植物抗病中起着非常关键的作用[15-16]。研究表明，在病原菌侵染时，通过诱导SARD1上调ICS1表达，增加SA的积累和抗病相关基因的表达,可增强烟草对番茄花叶病毒[16-17]、拟南芥对紫丁香叶枯病菌[18]、丁香假单胞菌[19]以及苹果对白僵菌[20]、灰霉病菌[21]的抗性。然而ICS1和SARD1在单子叶作物玉米中的功能尚有待研究。

为探究ZmICS1和ZmSARD1在玉米生物胁迫中的作用，本研究纯化了His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白，并免疫家兔制备了多克隆抗体，用不同质量浓度抗原检测抗体效价时，多克隆抗体Anti-ZmICS1可检测到3 ng重组蛋白，而Anti-ZmSARD1则能检测到0.3 ng重组蛋白，可知Anti-ZmSARD1灵敏度更高，这是由于抗原不同，其免疫原性不同所致。为明确抗体特异性，本研究检测了内源ZmICS1和ZmSARD1表达情况，正常条件下ZmICS1和ZmSARD1有着较低的积累量，维持着SA本底水平，与Sun等[22]的研究结果一致。在叶肉原生质体细胞中过表达ZmICS1和ZmSARD1后可检测到较高积累量。这些结果表明，制备的Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1多克隆抗体对玉米内源的目的蛋白有较好的特异性。

本研究制备ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗体，旨在检测内源ZmICS1、ZmSARD1的表达水平、组织定位，阐明ZmICS1、ZmSARD1的生理功能，为玉米抵御生物胁迫作用机制的研究奠定了基础。