AMF根外菌丝对重金属铅的吸收与转运

金小霞，韦 满，程 康，唐 明，张好强

(1 西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100；2 华南农业大学 林学与风景园林学院，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642)

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)在自然生态系统中广泛分布，能够与陆地上80%以上植物形成共生体[1]。AMF侵染植物后形成直径仅有数微米的根外菌丝，根外菌丝高度分枝，有效增加了与土壤的接触面积，促进寄主植物对水分及氮、磷、钾等矿质元素的吸收[2-3]。

AMF不仅能够促进植物生长，还在植物抵抗铅胁迫方面发挥积极作用，主要通过调控植物吸收养分和提高生物量以增强植物对铅胁迫的抗性。研究发现，接种AMF能够显著增加铅处理宿主植物的株高和地径，提高生物量[4]，增加叶绿素含量，提高光合效率[5]和营养元素(磷)含量[6]。此外，AMF还能增强植物根系的铅固定能力，提高根系铅含量并限制铅向地上部转移[7]，同时改善根际微生物环境[8]，并通过根外菌丝分泌土壤酶[9]和提高球囊霉素含量[10]来降低土壤铅毒害作用[11]。

异形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis，Ri)和摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae，Fm)是土壤中常见的2种AMF，常用于比较不同AMF种类的功能差异[12]。研究表明，接种异形根孢囊霉主要可增加宿主植物光合速率[13]，降低植株丙二醛含量和提高抗氧化酶活性[14]，增强植株的抗氧化能力，促进植株对钾和磷元素的吸收[15-16]；接种摩西斗管囊霉则主要表现出更强的促生作用、水分利用效率[17]和根系定植能力[18]。

以往针对AMF调控宿主植物铅吸收的盆栽试验中，植物根系与AMF根外菌丝生长在一起，因此不能明确菌根植物根系铅吸收是否来自AMF根外菌丝。因此，本研究以菌根植物蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和非菌根植物油菜(Brassicanapus)为供试植物，利用三室(菌根室-施铅室-非菌根室)培养系统(仅AMF根外菌丝能够穿透各分室间滤膜，铅仅与AMF根外菌丝接触)，当AMF根外菌丝从菌根室生长到非菌根室后在施铅室进行铅处理，通过比较菌根植物与非菌根植物铅含量差异以及2种AMF的作用差异，明确异形根孢囊霉和摩西斗管囊霉根外菌丝的铅转运能力，为明确AMF根外菌丝的铅转运机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植物 蒺藜苜蓿A17(Medicagotruncatula)种子由柏林洪堡大学Philipp Franken教授馈赠，油菜(Brassicanapus)种子购于陕西省杨凌种子市场。蒺藜苜蓿种子用浓硫酸(质量分数95%～98%)处理10 min，无菌水冲洗干净于4 ℃冰箱放置2 h，然后将种子均匀置于7 g/L水琼脂培养基中，4 ℃暗培养4 d，25 ℃下暗培养1 d，25 ℃光照培养3 d催芽，种子萌发后于穴盘中育苗。油菜种子依次用体积分数75%乙醇和10 g/L NaClO溶液表面消毒，无菌水多次冲洗后置于放有湿润无菌滤纸的灭菌培养皿中，25 ℃下光照培养4 d，待胚根长出后于穴盘中育苗。

1.1.2 供试菌剂 摩西斗管囊霉(Fm)和异形根孢囊霉(Ri)均由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。以河沙为基质，以车前草(Plantagoasiatica)为宿主进行扩繁，供试菌剂包含孢子(孢子密度约20个/g)、菌丝、侵染根段。

1.1.3 供试基质 培养基质为过2 mm筛的河沙和蛭石混合物(河沙与蛭石体积比为1∶1)，121 ℃灭菌2 h后风干备用。培养基质速效氮、速效磷、速效钾含量分别为11.25，2.58，25.08 mg/kg，铅含量为6.27 mg/kg。

1.2 试验设计

试验利用三室培养系统，该系统由3个大小相等(长×宽×高为7 cm×7 cm×10 cm)的亚克力有机玻璃隔室组合而成，包括1个中心隔室(施铅室)和2个侧隔室(菌根室和非菌根室)。中心隔室两边留有5 cm直径孔穴，2个侧隔室一边留有5 cm孔穴，将3个分室组合固定作为三室培养系统，具体结构如图1所示。

图1 三室培养系统示意图Fig.1 Schematic diagram of the three-chamber culture system

孔穴之间由38 μm滤布隔开，允许AMF根外菌丝通过而植物根系无法通过，从而将植物根系与丛枝菌根真菌根外菌丝有效分离。

试验设AMF和铅2个试验因素。其中菌根室种植蒺藜苜蓿，进行AMF处理，包括接种Ri、Fm和未接种对照(CK)；中间隔室设置铅处理，设置铅 含量为0和800 mg/kg 2个处理；非菌根室种植油菜。试验采用完全随机区组设计，设置6个处理组合，即CK、Ri、Fm、Pb、Ri×Pb、Fm×Pb。其中CK、Ri、Fm分别表示在菌根室设置不接种、接种异形根孢囊霉、接种摩西斗管囊霉处理基础上，于施铅室进行0 mg/kg Pb2+处理；Pb、Ri×Pb、Fm×Pb分别表示在菌根室设置不接种、接种异形根孢囊霉、接种摩西斗管囊霉处理基础上，于施铅室进行800 mg/kg Pb2+处理，每处理3次重复，取平均值。

菌根室装280 g培养基质，在5 cm深处接种20 g AMF菌剂，对照接种等体积灭菌沙，选取2株长势一致的蒺藜苜蓿幼苗移栽到菌根室；非菌根室装300 g培养基质，选取10株长势一致的油菜幼苗移栽到非菌根室；中间隔室装300 g培养基质。另外，2个AMF接种处理各多设3个重复(检测组)，在菌根室和非菌根室都种植蒺藜苜蓿幼苗用以确认AMF根外菌丝的生长(通过测定菌根室和非菌根室植物根系AMF侵染率)。培养条件为：光照强度2 000 lx，温度22～28 ℃，相对湿度50%～75%。铅处理前每2 d浇1次水(20 mL/室)，以保证幼苗的正常生长；每3 d浇1次含1/10磷元素的Hoagland营养液(20 mL/室)。幼苗移栽后培养8周，在检测组菌根室和非菌根室蒺藜苜蓿根系均检测到菌根定植后，在相应的中间隔室(施铅室)进行铅处理，通过注射器将20 mL 28 g/L Pb(NO3)2溶液注入培养基质，使培养基质铅含量达到800 mg/kg，4周后分别收获植株地上部和地下部，用于生理指标测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生物量 将蒺藜苜蓿和油菜地上部和根系分开收获，留取部分根系剪成1 cm长根段用于测定菌根侵染率，剩余植株根系和地上部样品经105 ℃杀青30 min，70 ℃烘48 h至恒质量后称取干质量。

1.3.2 侵染率 采用曲利苯蓝染色-根段法[19]测定。随机挑选30条完成脱色的根段制片镜检，将每条根的分级定义输入“MYCOCALC”软件，计算菌根侵染率、侵染根段强度、侵染根段丛枝丰度[20]，其具体计算公式如下：

菌根侵染率=(菌根侵染的根段数/检测的根段总数)×100%；

侵染根段强度=(根系的菌根侵染强度/菌根侵染率)×100%；

侵染根段丛枝丰度=(根系的丛枝丰度/菌根侵染率)×100%。

1.3.3 菌丝密度 取部分混合均匀的培养基质样品，采用真空泵微孔滤膜抽滤-网格交叉法[21]测定培养基质中菌丝密度。

1.3.4 铅含量 将植物地上部和根系样品分别粉碎过孔径为0.15 mm筛，用硝酸消解后采用火焰原子吸收法[22]测定地上部和根系铅含量。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2020软件进行数据统计，采用SPSS 25对试验数据进行单因素方差分析和多重比较(P<0.05)，使用Origin Pro 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 铅处理下接种AMF对植物生长的影响

由图2-A可知，与CK处理相比，Ri、Fm处理蒺藜苜蓿总生物量分别提高了43.55%和256.98%；与Pb处理相比，Ri×Pb和Fm×Pb处理蒺藜苜蓿总生物量分别提高了62.17%和210.83%。Fm×Pb处理蒺藜苜蓿地上部和根系生物量分别是Ri×Pb处理的1.69和3.17倍，表明接种Fm比接种Ri更能促进蒺藜苜蓿的生长。

A.蒺藜苜蓿；B.油菜。图柱上标不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同 A.Medicago truncatula;B.Brassica napus.Different lowercase letters indicate significant difference among treatments(P<0.05).The same below图2 铅胁迫下接种AMF对蒺藜苜蓿和油菜幼苗生物量的影响Fig.2 Effect of AMF inoculation on biomass of Medicago truncatula and Brassica napus seedlings under Pb treatment

由图2-B可知，与CK处理相比，Fm处理油菜根系生物量显著下降了46.80%，地上部生物量下降了21.16%。与Fm处理相比，Ri处理油菜总生物量显著升高87.45%。其他处理间油菜总生物量无显著差异。

2.2 铅处理下接种AMF对植物根系侵染率的影响

本研究发现，非菌根植物油菜根系未被AMF侵染，菌根植物蒺藜苜蓿根系被AMF侵染形成菌根的情况如图3所示。由图3可知，未接种蒺藜苜蓿根系未被AMF侵染(图3-A、D)，接种Fm和Ri处理的蒺藜苜蓿根系均被侵染,并形成根内菌丝、孢子、泡囊(图3-B、E)和丛枝(图3-C、F)等典型丛枝菌根结构。

A.CK处理；B.Ri处理；C.Fm处理；D.Pb处理；E.Ri×Pb处理；F.Fm×Pb处理 ih.根内菌丝；a.丛枝；v.泡囊；s.孢子 A.CK treatment；B.Ri treatment；C.Fm treatment；D.Pb treatment；E.Ri×Pb treatment；F.Fm×Pb treatment ih.Intraradical hyphae;a.Arbuscule;v.Vesicle;s.Spore图3 AMF侵染蒺藜苜蓿根系后主要菌根的结构Fig.3 Structure of main mycorrhiza after AMF infection to M. truncatula roots

由表1可知，与Ri处理比，Ri×Pb处理蒺藜苜蓿菌根侵染率无显著变化，侵染根段菌根侵染强度降低了25.93%，侵染根段丛枝丰度显著增加了225.24%；与Fm处理比，Fm×Pb处理蒺藜苜蓿菌根侵染率显著降低了40.16%，侵染根段菌根侵染强度降低了42.42%，侵染根段丛枝丰度无显著变化。Fm和Fm×Pb处理侵染根段丛枝丰度分别是Ri、Ri×Pb处理的8.75和2.51倍。表明同一铅水平下2种AMF对蒺藜苜蓿根系的侵染能力存在显著差异，Fm对铅处理更敏感，且主要是丛枝定殖根系。

表1 不同铅水平下AMF对蒺藜苜蓿根系的侵染状况Table 1 Infection of AMF on roots of M. truncatula under different Pb levels

2.3 铅处理下接种AMF对培养基质中菌丝密度的影响

不同铅水平处理下，三室培养系统中接种AMF后培养基质中菌丝密度如图4所示。由图4可知，在未接种AMF的CK中未发现根外菌丝；根外菌丝在施铅室和非菌根室中增殖，且这些隔室中未发现植物根系。与0 mg/kg铅水平下接种Ri、Fm相比，800 mg/kg铅水平下接种Ri、Fm菌根室菌丝密度分别显著提高了231.57%和314.09%，施铅室菌丝密度分别显著降低了49.56%和21.09%。AMF根外菌丝可以延伸到非菌根室，但不同铅水平下接种AMF对非菌根室菌丝密度无显著影响。

A.菌根室；B.施铅室；C.非菌根室。ND表示未检测到菌丝 A.Mycorrhiza chamber;B.Pb application chamber;C.Non-mycorrhiza chamber.ND indicates that mycelium is not detected图4 不同铅水平下接种AMF对三室培养系统中培养基质菌丝密度的影响Fig.4 Effect of AMF inoculation under different Pb levels on extraradical hyphae density of culture substrate in the three-chamber culture system

2.4 铅处理下接种AMF对植物铅含量的影响

铅处理下接种AMF对菌根植物蒺藜苜蓿和非菌根植物油菜铅含量的影响如图5和图6所示。

图5 铅处理下接种AMF对蒺藜苜蓿铅含量的影响Fig.5 Effect of AMF inoculation on Pb content in M. truncatula under Pb treatment

图6 铅处理下接种AMF对油菜铅含量的影响Fig.6 Effect of AMF inoculation on Pb content in B. napus under Pb treatment

由图5可知，0 mg/kg铅水平下，与CK处理相比，接种Ri、Fm 处理中AMF根外菌丝显著促进了铅运输至蒺藜苜蓿地上部的转运过程。800 mg/kg铅水平下，与CK处理相比，接种Ri和Fm其根外菌丝转运至蒺藜苜蓿地上部和根系的铅含量显著升高，分别是CK的3.60，8.45和7.45，217.87倍。

由图6可知，800 mg/kg铅水平下，与CK处理相比，接种Fm处理显著促进了根外菌丝吸收转运铅至非菌根室油菜根系，其铅含量是CK的62.15倍。因此，在铅处理下，接种Ri、Fm能够促进根外菌丝对铅的吸收转运，且接种Fm的促进作用更显著。

3 讨 论

菌丝网络能够提高菌根植物的竞争能力[23]，根外菌丝介导下AMF不利于临近非菌根物种(尤其是十字花科植物)的生长[24]。本研究中，与CK处理相比， Fm处理显著提高了菌根室蒺藜苜蓿的生物量，降低了非菌根室油菜的生物量，表明其抑制了同系统下非菌根植物油菜的生长。一方面是由于AMF能够借助根外菌丝在植物根系与基质之间建立物质传输通道[25]，吸收矿质养分供给寄主[26]；另一方面是根外菌丝能改变根际分泌物或菌丝相关细菌群落，进而影响植物养分吸收[27]。

菌根侵染率反映了AMF在植物根内的生长状况，关系到真菌与宿主之间的双向营养运输。本研究中，铅处理显著降低了Fm处理的菌根侵染率，这可能是根外菌丝接触到铅后，营养吸收受到了抑制。丛枝是AMF与植物共生关系形成后二者物质交换的主要场所[28]。本研究中，与0 mg/kg铅水平相比，800 mg/kg铅水平下Ri处理的侵染根段丛枝丰度显著增加，这可能是铅胁迫下AMF在植物根系内的生存机制[29]。本研究中，无论铅胁迫与否， Ri处理的侵染根段丛枝丰度显著低于Fm处理，这可能是造成2种AMF处理对寄主植物生长有明显差异的主要原因。本研究中，与0 mg/kg铅水平相比，800 mg/kg铅水平下Ri、Fm处理显著提高了菌根室培养基质的菌丝密度，但降低了施铅室培养基质的菌丝密度，这可能是由于菌丝接触铅后的“逃避”策略，限制了菌丝的生长，导致更多菌丝滞留在菌根室。

陈雪等[30]研究表明，不同AMF对重金属的富集和转运能力不同，铅胁迫下接种Fm的麦冬铅含量高于接种Ri。本研究中，与0 mg/kg铅水平相比，800 mg/kg铅胁迫下，Fm处理蒺藜苜蓿根系的铅含量显著高于接种Ri，可知利用根外菌丝对铅的转运来修复植物，选择寄主和AMF的组合具有重要意义。菌根植物常常将更多的铅固定在根系，以保证地上部免受损害。本研究中，800 mg/kg铅胁迫下，Fm和Ri处理明显增加了蒺藜苜蓿地上部和根系对铅的吸收，尤其是根系对铅的吸收，说明接种AMF后植物根系对重金属铅有较强的固持作用，这与前人的研究结果[31-32]一致。此外，根外菌丝在接触铅后，将铅向油菜转运，从而增加了油菜根系对铅的吸收，这可能是根外菌丝吸收转运重金属存在外排现象[33]。

4 结 论

本试验首次利用三室培养系统(菌根室-施铅室-非菌根室)，研究了铅胁迫下Ri、Fm 2种AMF根外菌丝对菌根植物蒺藜苜蓿(寄主)和非菌根植物油菜植物生长及铅富集的影响，结果表明，AMF根外菌丝能够直接吸收土壤铅并转运固持在寄主植物根系，还可借由“外排”效应将铅转运至非菌根植物根系，且与Ri相比，Fm具有更强的促进寄主生长和铅转运能力。