右美托咪定抑制高糖诱导心脏成纤维细胞激活的机制研究

单跃 徐利丽 周其富

右美托咪定是一种在临床上广泛使用的麻醉药物，具有镇静、镇痛和抗焦虑等作用，目前也应用于ICU内气管使用呼吸机辅助呼吸患者的镇静。右美托咪定对包括心脏、肾脏、肺、肝脏等多种器官具有抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡的作用。在心血管领域，一项Meta分析结果显示，对于行外科心脏手术的患者，右美托咪定具有保护心肌细胞和抗炎的作用[1]。但是右美托咪定作为一种常用的镇静类药物，其是否具有抑制高糖诱导的心脏损伤作用，目前报道较少。

在各种病理因素作用下，心脏成纤维细胞由静止型活化为激活型，增殖和迁移能力增加，并开始大量分泌金属基质蛋白酶2和抗金属基质蛋白酶1等影响细胞外基质动态平衡的蛋白酶，造成心脏间质的纤维化，最终导致心肌重构[2]。在心脏成纤维细胞的激活过程中平滑肌细胞抗体（SMα）、人转录因子21（Tcf21）等蛋白的表达增加，在后续研究中常检测SMα和Tcf21表达量来鉴别心脏成纤维细胞的激活强度[3]。前期研究中发现高糖导致的心脏成纤维细胞激活是高糖损伤心脏的重要环节[4]。本研究通过右美托咪定干预高糖诱导的心脏成纤维细胞激活模型，探索右美托咪定对心脏的保护作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 心脏成纤维细胞购自湖北普诺赛生命科技有限公司；右美托咪定购自江苏恒瑞医药公司；FBS、胰酶购自美国Gibco公司；DMEM培养基、葡萄糖、PBS购自杭州吉诺公司；二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）、胸腺嘧啶核苷（EdU）购自美国Emresco公司；Transwell小室购自美国康宁公司；二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自美国Rcohe公司；TRIzol RNA试剂盒、逆转录试剂盒购自美国 Invitrogen公司；SMα、Tcf21、性别决定区 Y框 4（SOX4）抗体购自美国Abcom公司；辣根过氧化酶及FITC标记的二抗购自美国Jackson公司；Western blot相关试剂购自江苏碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 将心脏成纤维细胞分为对照组、高糖组和右美托咪定组（Dex组）3组。对照组细胞培养基内不加任何干预药物，高糖组加入30 mmol/L葡萄糖，Dex组加入30 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L右美托咪定。

1.2.2 细胞形态观察 将4～7代的心脏成纤维细胞经胰蛋白酶消化后接种于6孔板，每孔接种1×106个细胞，待细胞贴壁后，上述各组加入相应干预药物，置于37℃、5%CO2孵箱培养，每12 h光镜下观察记录各组细胞形态。

1.2.3 细胞增殖能力检测 （1）MTT法：将上述消化后的心脏成纤维细胞以每孔6×103个接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后，上述各组加入相应干预药物，置于37 ℃、5%CO2孵箱培养12、24、48 h。干预结束后，每孔加入MTT液20 μl，孵箱中继续孵育4 h。吸去培养液，加入150 μl二甲基亚砜溶液，摇晃10 min后酶标仪上检测各组吸光度（波长490 nm）。实验重复3次。（2）EdU法：将培养24 h后的细胞再用EdU 100 μl孵育2 h，吸去上清液，4%多聚甲醛固定细胞，加入2 μg/ml的DAPI染细胞核，PBS冲洗3次，荧光显微镜下计数EdU染色阳性（红色）细胞数并记录。实验重复3次。

1.2.4 细胞迁移能力检测 （1）细胞划痕实验：将4～7代的心脏成纤维细胞消化后接种于6孔板，待细胞长至80%左右后，采用无血清培养基培养24 h使细胞同步化。使用枪头制造划痕并吸弃细胞碎片，上述各组加入相应干预药物，置于37℃、5%CO2孵箱培养48 h。每隔4 h光镜下拍照记录各组细胞的生长情况，最后采用Image pro plus 6.0软件计算各组细胞的迁移面积。实验重复3次。（2）Transwell法：将4～7代的心脏成纤维细胞消化后接种于Transwell小室（0.8 μm）上室，上述各组加入相应干预药物，下室中加入含血清的完全培养基。细胞于37℃、5%CO2孵箱培养12、24 h后，取下并使用PBS清洗Transwell半透膜，使用4%多聚甲醛固定，采用2 μg/ml的DAPI染细胞核，PBS冲洗3次后，荧光显微镜下观察记录穿膜细胞数。实验重复3次。

1.2.5 SMα、Tcf21和SOX4蛋白表达的检测 采用Western blot法。各组细胞经干预、孵育48 h后，吸去培养液，使用细胞裂解液裂解细胞，提取细胞中的蛋白质。然后每孔加入15 μl蛋白样品，凝胶电泳后将蛋白转至PVDF膜，TBST洗膜后使用血清封闭1 h，加入SMα、Tcf21和SOX4一抗，4℃摇床过夜，TBST洗去一抗后加入二抗常温孵育2 h，暗室中使用ECL化学发光法曝光后在柯达胶片上显影，采用Quantity one软件定量分析各条带浓度。实验重复3次。

1.2.6 SOX4在细胞中的分布及表达 采用细胞免疫荧光法。将各组心脏成纤维细胞加入96孔板，待细胞贴壁后上述各组加入相应干预药物，孵育48 h后，弃培养液，PBS清洗后使用4%多聚甲醛固定细胞，加入0.25%Triton溶液破坏细胞膜，加入山羊血清封闭，1 h后加入SOX4一抗，4℃摇床过夜，TBST洗去一抗后加入荧光标记的二抗常温孵育2 h，TBST清洗后使用荧光显微镜拍照记录。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组心脏成纤维细胞形态的比较 光镜下，对照组心脏成纤维细胞细长，呈典型的“梭形”，高糖组细胞失去细长的形态，逐渐变短、变圆，Dex组细胞恢复细长的梭状形态，见图1。

图1 3组光镜下心脏成纤维细胞形态（a：对照组；b：高糖组：c：Dex组；×200）

2.2 3组心脏成纤维细胞增殖能力比较 MTT和EdU实验结果显示，与对照组比较，高糖组心脏成纤维细胞增殖明显（P＜0.05）；与高糖组比较，Dex组细胞增殖能力降低（P＜0.05），见图2（插页）、3。

图2 3组心脏成纤维细胞EdU实验染色结果

图3 3组心脏成纤维细胞增殖能力比较（a：3组细胞EdU染色阳性细胞百分比的比较；与对照组比较，*P＜0.05；与高糖组比较，△P＜0.05；b：3组细胞MTT实验结果的比较）

2.3 3组心脏成纤维细胞迁移能力的比较 细胞划痕和Transwell实验结果显示，与对照组比较，高糖组细胞迁移能力增加（P＜0.05）；与高糖组比较，Dex组细胞迁移能力降低（P＜0.05），见图4。

图4 3组心脏成纤维细胞迁移能力比较（a：细胞划痕实验结果；b：3组细胞迁移面积的比较；c：3组细胞穿透膜细胞数量的比较；d：Transwell实验结果，DAPI染色，×200）

2.4 3组心脏成纤维细胞中SMα和Tcf21的表达比较 Western blot结果显示，与对照组比较，高糖组细胞中SMα和Tcf21相对表达量均增加（均P＜0.05）；与高糖组比较，Dex组细胞中SMα和Tcf21相对表达量均减少（均P＜0.05），见图5。

图5 3组心脏成纤维细胞中SMα和Tcf21表达的比较（a：3组细胞SMα和Tcf21表达的电泳图；b：3组细胞SMα相对表达量的比较；c：3组细胞Tcf21相对表达量的比较）

2.5 3组心脏成纤维细胞中SOX4表达比较 细胞免疫荧光染色结果显示心脏成纤维细胞中SOX4少量表达，高糖能促进心脏成纤维细胞中SOX4表达；与高糖组比较，Dex组细胞中SOX4表达减少，见图6（插页）。Western blot实验结果显示，与对照组比较，高糖组细胞中SOX4表达增加（P＜0.05）；与高糖组比较，Dex组细胞中SOX4表达减少（P＜0.05），见图7。

图6 3组心脏成纤维细胞SOX4表达和分布（免疫荧光染色）

图7 3组心脏成纤维细胞SOX4表达（a：3组心脏成纤维细胞SOX4表达电脉图；b：3组心脏成纤维细胞SOX4表达量比较；与对照组比较，*P＜0.05；与高糖组比较，△P＜0.05）

3 讨论

在正常心脏组织中，心脏成纤维细胞处于“静息”状态，其主要起构成心脏网状纤维结构的作用。静止型心脏成纤维细胞外观呈“梭形”，增殖和迁移能力弱[2]。当受到各种炎症介质、细胞因子、物理张力等病理因素刺激的作用下，静止型的心脏成纤维细胞被激活，转化成激活型的成纤维细胞，最终导致心脏重构，影响心脏的收缩和舒张功能。激活型的细胞具有以下特点：（1）各种促炎和促纤维化因子表达水平升高，直接促成炎症细胞浸润和成纤维细胞增殖；（2）分泌高水平的基质金属蛋白酶以促进成纤维细胞迁移；（3）促进胶原蛋白和其他血管基底膜蛋白的沉积，导致瘢痕形成；（4）表达SMα、Tcf21等特异性的标志蛋白[5-8]。有研究发现高糖通过诱导葡萄糖转运蛋白1的表达从而促进心脏成纤维细胞的激活[9]。

随着糖尿病发病率的不断上升，气管插管在长期使用呼吸机的糖尿病患者中比例不断提升。插管患者使用的麻醉镇静药物是否具有减少高糖对全身器官组织的损伤是目前学术界的研究热点。Iida等[10]研究结果显示丙泊酚可以抑制血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞迁移。Sun等[11]研究表明麻醉药物咪达唑仑可以通过调节miR-194-5p/HOOK3轴降低非小细胞肺癌细胞对顺铂的耐药性，从而提高药物的化疗效果。在心血管领域中，Ok等[12]研究发现右美托咪定可以通过激活PKC途径，诱导肌球蛋白磷酸酶抑制蛋白的磷酸化，提高其钙离子敏感性，最终增加心脏的收缩能力。与上述研究结果相符，本研究使用右美托咪定干预高糖诱导的心脏成纤维细胞激活模型，发现右美托咪定不仅可以抑制高糖诱导的心脏成纤维细胞增殖和迁移，同时还可以抑制心脏成纤维细胞中SMα、Tcf21等心脏成纤维细胞激活特异性标志蛋白的表达，表明右美托咪定具有抑制高糖诱导心脏成纤维细胞激活的作用。上述结果提示对于长期使用呼吸机的糖尿病患者，使用右美托咪定镇静麻醉可能具有保护高糖引起心脏损伤的作用。

SOX4基因在中枢神经系统、心脏、胸腺、肿瘤等器官组织中都有表达，对包括心肌细胞在内的多种细胞的稳定和分化具有关键的调控作用。已有研究证明SOX4基因的表达与先天性疾病、心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病等多种疾病的发生、发展密切相关，靶向抑制SOX4的表达可以降低细胞的增殖能力[13-14]。有研究结果显示，circHIPK3通过调节miR-338-3p的表达，进而增加SOX4在成纤维细胞中的表达量，最终激活成纤维细胞[15]。为了进一步探索右美托咪定是通过何种途径发挥其抑制高糖诱导的心脏成纤维细胞激活的作用，本研究通过细胞免疫荧光及Western blot检测了各组细胞中SOX4的表达情况，结果显示右美托咪定在抑制高糖诱导心脏成纤维细胞激活的同时，可以抑制细胞中SOX4的表达。

综上所述，本研究右美托咪定干预高糖诱导的心脏成纤维细胞激活模型，发现高糖组细胞外形变大变圆，失去纤维细胞典型的“梭状”形态，细胞增殖和迁移能力增加，细胞中SMα、Tcf21和SOX4的表达增加，而右美托咪定可以减弱高糖对心脏成纤维细胞的上述影响，笔者推测右美托咪定可能是通过抑制SOX4表达，从而发挥抑制高糖诱导心脏成纤维细胞激活的作用。本研究仅从细胞层面验证了上述结果，并没有在体层面证实，这是本研究的一大局限。