不同苹果中间砧枝条在越冬期间的生理特性变化及抗寒性比较

井俊丽，刘铭潇，高美娜，徐继忠，张学英，周莎莎

（河北农业大学 园艺学院，保定 071000）

苹果在我国栽培历史悠久,在促进农民增收和区域经济发展等方面发挥着重要作用，苹果产业在我国发展中占有重要地位［1］。然而，苹果产业的发展却受到低温因素的限制。在我国北方地区，每年冬季都易发生冻害，抗寒性差的苹果树枝干受冻严重，出现抽条现象，甚至有些地区会使树木冻死［2］。另外，春季也常发生冻害，以河北省为例，2020 年4 月，河北省多个县市出现大风降温现象，此次降温造成省内多地区遭受低温冻害，受灾面积较广，有些品种的苹果花器器官出现不同程度的冻害［3］。冻害严重影响了苹果树体质量和产量，给果农造成严重经济损失。由此可见，提高苹果抗寒性的工作至关重要。砧木直接影响接穗的抗寒性，正确选择砧木，可以提高苹果树的抗寒性［4］。

近年来，有关苹果砧木抗寒性的研究报道很多。有学者采用人工低温处理的方法利用半致死温度结合生理指标对苹果砧木做出抗寒性评价［5-6］。有学者研究自然越冬过程中利用电解质渗透率和生理指标研究测定苹果砧木的抗寒性［7］。研究植物的生理生化特征，正确鉴定植物的抗寒性能，对物种保护和育种均具有重要意义［8］。目前苹果矮砧密植栽培中SH40 砧木应用较多［9］，SH40 是我国北方苹果产区推广的抗寒性较强的矮化砧木之一［10］。GM256 是吉林省农科院果树研究所培育的抗寒性强的矮化中间砧［11］，是目前生产上表现良好的优良抗寒矮化砧木。本试验选用应用较多的SH40 和抗寒性强的GM256 作为对照，期待能够对本研究中其它砧木的抗寒性提供参考依据。

以本团队新培育的1 号、15-1、24-5、ZC9-3 砧木及抗寒性较强的GM256 和SH40 的1 年生苹果休眠枝条为试材，对其越冬过程中的半致死温度、SOD 和POD 酶活性、可溶性蛋白、MDA、脯氨酸和可溶性糖等生理指标进行测定，研究各苹果砧木枝条在越冬过程中生理适应特性和变化规律，并利用主成分分析和聚类分析综合评价6 种苹果中间砧的抗寒性，筛选出抗寒性强的新的优良苹果砧木，以期为植物抗性生理机制的研究和苹果抗寒砧木的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以6 种苹果中间砧（河北农业大学苹果砧木创新团队新选育的编号分别为1 号、15-1、24-5、ZC9-3 的4 种砧木，抗寒性较强的GM256 和生产上常用的SH40 为对照）的1 年生休眠期枝条为试验材料，基砧均为无融合生殖的‘平邑甜茶’（Malus hupehensisvar. pingyiensis）。试材地点位于河北农业大学西校区，盆栽法种植。每种砧木选择生长势一致的30 株进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 取样与处理 分别于 2020 年11 月07 日、2020 年12 月07 日、2021 年1 月05 日、2021 年3 月05 日取样，取样期间每月的平均最高气温分别为11.70、3.80、3.06、14.29 ℃，平均最低气温分别为0.63、-9.06、-9.48、4.16 ℃，月平均气温分别为5.97、-2.94、-3.20、9.12 ℃。取样当天的气温情况见表 1。每种砧木采取健壮一致、无病虫害的1 年生休眠枝条。枝条采后洗净带回，一部分枝条取其枝皮，液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存待测生理指标；另一部分枝条每种砧木分装6 个自封袋中进行6 个低温处理，测定相对电导率，求低温半致死温度。

表1 各苹果砧木越冬期取样当天的气温情况Table 1 Temperature on the sampling day of each apple rootstock during overwintering period

1.2.2 低温处理 低温处理参照金明丽［4］的方法。使用可变温的超低温冰箱进行人工冷冻处理，每次设定6 个温度梯度（表2），低温处理后的枝条用于测定相对电导率。

表2 4 次低温处理测定抗寒性所设温度Table 2 Set temperature for cold resistance determination after 4 low temperature treatments

1.2.3 测定相对电导率 参照金明丽［4］、杨雪［12］和张刚［13］等人的方法计算相对电导率（E）和半致死温度（LT50），测定电导率的方法略有改动。将已低温处理好的枝条切成15 mm 长的枝段，中间十字劈开，放入装有10 mL 超纯水的试管中。在摇床上震荡 24 h 后用DDS-307A 型电导率仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）测定初电导值R1和空白电导值R0。沸水浴30 min 后，再次放到摇床上震荡24 h 后，测终电导值R2。按公式E(%)=(R1-R0)/(R2-R0)×100 计算各处理的相对电导率E。

1.2.4 测定相关生理指标 生理生化指标测定：每个砧木3 次生物学重复。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量［14］；采用NBT 法测定超氧化物歧化酶活性［4］；采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性［4］；采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量［4］；采用考马斯亮蓝G-250 染色法测定可溶性蛋白含量［15］；采用酸性茚三酮染色法测定脯氨酸含量［15］。

1.2.5 数据分析 利用Microsoft Excel 2010 进行数据统计和作图，利用SPSS 21.0 软件进行拟合半致死温度、聚类分析、主成分分析和生理指标差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 越冬过程中各苹果砧木枝条半致死温度（LT50）的变化

测得不同低温胁迫处理下各苹果中间砧枝条的相对电导率，并结合Logistic 方程求得各苹果砧木的低温半致死温度（LT50）。结果如图1 所示，在越冬过程中，各苹果砧木枝条半致死温度变化与冬季气温变化趋势相对应，呈先降低后升高的趋势。随气温降低，胁迫加剧，各苹果砧木相应半致死温度降低，随后气温回升，半致死温度也随之上升。各苹果砧木枝条半致死温度均在1 月份达到最低，抗寒性最强。在最冷的1 月份，15-1、1 号和GM256的半致死温度显著低于24-5、SH40 和ZC9-3 的半致死温度，表现出较强的抗寒性。

图1 越冬过程中各苹果砧木枝条半致死温度（LT50）的变化Fig.1 Changes of half lethal temperature (LT50) of branches of apple rootstocks during overwintering

2.2 自然越冬过程中各苹果砧木枝条生理指标的动态变化

2.2.1 丙二醛（MDA）含量的变化 如图2 所示，大多数苹果砧木枝条MDA 含量变化与冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。随自然温度的降低，各苹果砧木枝条中的MDA 含量有所增加，随后低温持续加剧，各苹果砧木枝条中的MDA 含量呈急剧上升的趋势，升高的幅度因砧木特性的不同而不同，在1 月份达到最值。随后，冬季气温回升，胁迫减轻，各苹果砧木枝条中的MDA 含量均呈下降趋势。其中15-1 的MDA 含量变化略有差异，在整个越冬过程中MDA 持续升高。在整个越冬过程中，GM256 和1 号的MDA 含量相对较低。ZC9-3、24-5 和15-1 的MDA 含量相对较高。

图2 越冬过程中各苹果砧木枝条丙二醛（MDA）含量的变化Fig.2 Changes of malondialdehyde (MDA) content in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化 如图3 所示，各苹果砧木枝条SOD 活性变化与冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。随自然温度的降低，各苹果砧木枝条的SOD 活性均有不同程度的增加，且均在1 月份低温胁迫最严重时SOD 活性升至最高。随后，冬季气温回升，各苹果砧木枝条SOD 活性均呈下降趋势。在整个越冬过程中，15-1、GM256、1 号、SH40 和24-5 的SOD 活性较高。ZC9-3 的SOD 活性始终较低。

图3 越冬过程中各苹果砧木枝条超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化Fig.3 Changes of superoxide dismutase (SOD) activity in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.3 过氧化物酶活性(POD)活性的变化 如图4所示，各苹果砧木枝条POD 活性变化与冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。随自然温度的降低，各苹果砧木枝条的POD 活性均有不同程度的增加，且均在1 月份温度胁迫最严重时POD 活性升至最高。随后，冬季气温回升，各苹果砧木枝条POD 活性呈下降趋势。在整个越冬过程中，15-1 和GM256 的POD 活性始终处于较高水平，显著高于其它砧木，且15-1 显著高于GM256 的POD 活性。ZC9-3、SH40 和24-5 的POD 活性一直处于较低水平，显著低于其它砧木。

图4 越冬过程中各苹果砧木枝条过氧化物酶(POD)活性的变化Fig.4 Changes of peroxidase (POD) activity in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.4 可溶性糖含量的变化 如图5 所示，各苹果砧木枝条的可溶性糖含量变化与冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。随自然温度的降低，各苹果砧木枝条的可溶性糖含量均有不同程度的增加，且均在1 月份温度胁迫最严重时可溶性糖含量升至最高。随后，冬季气温回升，各苹果砧木枝条可溶性糖含量呈下降趋势。在冬季低温胁迫前期，即2020 年11 月7 日，15-1 和1 号的可溶性糖含量显著高于其它几种砧木。

图5 越冬过程中各苹果砧木枝条可溶性糖含量的变化Fig.5 Changes of soluble sugar content in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.5 可溶性蛋白含量的变化 如图6 所示，各苹果砧木枝条可溶性蛋白含量变化与冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。随自然温度的降低，各苹果砧木枝条的可溶性蛋白含量均有不同程度的增加，且均在1 月份温度胁迫最严重时可溶性蛋白含量升至最高。随后，冬季气温回升，各苹果砧木枝条可溶性蛋白含量有所降低。在越冬过程中，GM256 的可溶性蛋白始终处于较高水平，显著高于其他砧木，前2 个时期显著高于其他砧木。

图6 越冬过程中各苹果砧木枝条可溶性蛋白含量的变Fig.6 Changes of soluble protein content in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.6 脯氨酸含量的变化 如图7 所示，大多数苹果砧木枝条脯氨酸含量变化与冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。随自然温度的降低，各苹果砧木枝条的脯氨酸含量均有不同程度的增加，且均在1 月份温度胁迫最严重时脯氨酸含量升至最高。随后，冬季气温回升，各苹果砧木枝条脯氨酸含量有所降低。在整个越冬过程中，各苹果砧木的脯氨酸含量差异显著。

图7 越冬过程中各苹果砧木枝条脯氨酸含量的变化Fig.7 Changes of proline content in branches of apple rootstocks during overwintering

2.3 自然越冬过程中各苹果砧木枝条抗寒性综合评价及抗寒分类

参照李捷［16］利用主成分分析综合评价抗寒性。根据综合得分值的大小判断抗寒力强弱，得分值越高则抗寒力越强，评价结果如表3 所示。利用主成分综合得分值进行聚类分析，聚类分析采用Ward 法。聚类结果如图8 所示，在欧氏距离为4.0 处，将 6个苹果砧木分为4 类，结合表4 综合得出：15-1 抗寒性最强；1 号和GM256 抗寒性较强；SH40 和24-5 抗寒性中等；ZC9-3 抗寒性最弱。6 种苹果砧木抗寒性由强到弱顺序为：15-1＞1 号＞GM256＞24-5＞SH40＞ZC9-3。

表3 各主成分得分、综合得分、抗寒排序及分类Table 3 Principal component scores, comprehensive scores, cold resistance ranking and classification

图8 各苹果砧木枝条抗寒性聚类分析Fig.8 Cluster analysis of cold resistance of branches of Apple Rootstocks

3 讨论

利用相对电导率结合 Logistic 方程求得植物低温半致死温度（LT50）来判断各植物品种间的抗寒性已在苹果、梨、核桃［17-19］等果树品种资源抗寒性鉴定中得到普遍应用。本研究中，各苹果砧木枝条在越冬期间的半致死温度变化与冬季气温变化趋势相同，呈先降低后升高趋势。原因是外界环境逐渐降低，植物经过抗寒锻炼后，调节自身生理机能，抗寒性逐渐提高。该研究结果与许瑛［20］等人研究结果一致。李翠红［21］在苹果矮化砧木抗寒性研究中表明GM256＞SH40，且半致死温度分别为-34.128、-27.380 ℃。此研究结果与本研究中作为对照的GM256 和SH40 的抗寒性强弱结果一致，但半致死温度存在差异，可能与地域差异、取材时间及树体年龄不同有关。另外，在李翠红［21］和杨凤秋［22］的研究中均表明GM256 属于抗寒性强的砧木，与本研究结果一致。本研究筛选出抗寒性比GM256 强的砧木1 种，编号为15-1，抗寒性与GM256 同样强的砧木1 种，编号为1 号。

低温胁迫下，可通过MDA 含量判断细胞膜受损伤程度和植物的抗寒性［23］。本研究中，大多数苹果砧木枝条在越冬期间的丙二醛含量呈先上升后下降的变化趋势，在冬季1 月份最冷时丙二醛含量最高，表明前期随温度胁迫程度加重，氧自由基大量积累，加剧了膜脂过氧化反应，质膜损伤程度加重，MDA 含量增加，1 月份温度最低，对质膜伤害最大，因此MDA 含量最高。这与王飞雪［24］和杨捷［25］的抗寒性研究的结果一致。后期MDA 含量降低，是由于春季温度回升后，低温胁迫减轻，各苹果砧木受伤的膜系统得到修复，因此MDA 含量降低。这与田爱菊［26］的抗寒性研究发现相同。

SOD 和POD 是植物体内重要的保护酶，植物体内酶活性的变化能够反映植物在低温胁迫后受伤的程度［27］。本研究中，各苹果砧木枝条在越冬期间的SOD 和POD 活性变化与冬季温度变化趋势相反，呈先上升后下降的变化趋势，在1 月份最冷时达到最值。表明随温度的降低，各苹果砧木能够增加自身保护酶活性提高抗寒性，以保护砧木枝条安全越冬。这与欧欢［28］对扁桃抗寒性研究结果一致。此外，抗寒性强的砧木枝条中SOD 和POD 活性始终高于抗寒性弱的砧木枝条。保护酶活性越高，说明其清除活性氧的能力越强，能够保护膜系统从而提高了植物的抗寒性。这与王贺［29］和郭改改［30］研究发现一致。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物中最常见的渗透调节物质［31］。可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的增加与植物的抗寒性存在相关性［32］。本研究中，各苹果砧木枝条在越冬期间的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量与冬季温度变化趋势相反，呈先上升后下降的变化趋势。前期随温度降低，低温胁迫加重，各苹果砧木增加自身渗透调节物质从而保证安全越冬，后期温度升高，低温胁迫减轻，含量降低。这与李叶云［33］和李鹏程［34］等人研究结果一致。这表明，低温胁迫下，各种渗透调节物质含量的增加，有助于提高细胞的浓度和保水能力，降低细胞的冰点，提高原生质体的保护能力，从而提高植物抗寒性［35］。

4 结论

6 个苹果砧木枝条的半致死温度低与冬季气温变化趋势相同，呈先降低后升高趋势；丙二醛含量、SOD 和POD 活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量与冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低趋势。6 种苹果砧木的抗寒性由强到弱顺序为：15-1＞1 号＞GM256＞24-5＞SH40＞ZC9-3。聚类分析得出，15-1 为抗寒性最强，强于GM256；1 号和GM256 为抗寒性较强；SH40 和24-5 抗寒性中等；ZC9-3 抗寒性较弱。