基于RNA-seq筛选影响猪肉品质的关键候选基因

肖明飞，申露露，何逸懿，易宏波，唐青松，李莉，洪兴，李大江，徐娥*

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州 510640；3.成都通威三新药业有限公司，四川成都 611500）

猪肉品质是养猪生产中最重要的目标性状之一。近年来，畜牧行业片面追求猪的生产性能，导致肉的风味变差，肉品质下降。从江香猪是贵州省著名地方小型猪种，属于国家二级保护畜种。从江香猪具有很强的环境适应性和抗病能力，具有高度纯合的基因水平，因肉质细嫩和味道鲜美而闻名。研究表明，从江香猪猪肉属于高蛋白和低热能的健康肉类，富含多种人体所必需的营养物质。近年来，转录组测序（RNA-seq）技术在畜牧行业得到广泛应用。张福平等通过RNAseq 发现了与从江香猪发情排卵密切相关的7 个候选基因（和）。María 等基于RNA-seq 研究表明，在纯种伊比利亚猪肌内脂肪中301 个转录调控因子参与表达差异，其中和参与脂肪生成，和参与骨骼肌的发育。此外，也有学者通过RNA-seq 技术初步证实了miRNA-499 和miRNA-22 是影响猪肉滴水损失性状的潜在调节因素。然而，目前关于从江香猪背最长肌的基因组学研究较少，从江香猪肉质与大白猪的关键功能基因鲜有报道。本研究基于RNA-seq 技术对香猪和大白猪背最长肌的表达谱差异进行分析，通过GO 和KEGG 筛选与猪肉品质相关的信号通路，挖掘影响猪肉品质形成的关键功能基因，以期为猪肉品质的改善提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集 实验在贵州大学种猪场进行，从江香猪与大白猪屠宰前的饲养管理均一致。选取90 日龄和胎次相同的健康雄性去势纯种从江香猪和大白猪各3 头，屠宰后采集背最长肌，液氮速冻转移保存在-80℃冰箱待测。

1.2 RNA-seq 测序和生物信息学分析 使用Trizol 试剂盒（Invitrogen，美国）提取上述采集的从江香猪和大白猪背最长肌总RNA，所得总RNA 浓度和纯度 经NanoDrop 2000（IMPLEN，美国）和Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，美国）检测，建立cDNA 文库和库检后，上机进行Illumina HiSeq测序，得到原始序列（Raw Reads），同时去除低质量和含杂质的序列得到有效序列（Clean Reads）。将从江香猪和大白猪背最长肌的测序结果进行转录注释并计算表达水平，以FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）作为基因表达水平估算指标（FPKM>1 作为判断基因表达的标准），同时将|log（Fold Change，FC）| ≥1 &<0.05为差异表达基因（DEGs）筛选条件，利用GOseq R 软件包对DEGs 进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，确定DEGs 行使的主要生物学功能；利用KOBAS（2.0）软件进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes，KEGG）Pathway 富集分析，确定2 个猪种差异表达基因参与的主要代谢途径和信号通路。Edge R 软件绘制差异表达基因的散点图和火山图。

1.3 实时荧光定量（qRT-PCR）验证 为进一步验证RNA-seq 结果的准确性，以2 μg 的总RNA 使用反转录试剂盒（TaKaRa，日本）逆转录得到20 μL 的第1 链cDNA，加入180 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水10 倍稀释用于实时荧光定量。每个样本独立重复3 次实验。目的基因和管家基因（GAPDH）的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。基因的相对表达量均采用2法计算。PCR 反应体系：94℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火和延伸30 s，40 个循环。

表1 实时荧光引物序列

1.4 数据统计与分析 结果使用Excel 2019 初步整理后，SPSS 18.0 软件进行单因素方差分析。利用GraphPad Prism 8.0 软件作图。结果以平均值和标准误表示，<0.05 为差异显著，<0.01 为差异极显著。

2 结果

2.1 RNA-seq 测序质量评估和参考序列比对 通过对从江香猪和大白猪的背最长肌进行高通量测序，从江香猪和大白猪分别获得45 568 778 条和47 475 542 条Raw reads，经过滤后，得到有效序列（Clean Reads）分别为42 41 202 134 条（从江香猪）和834 534 条（大白猪），结果如表2 所示。从江香猪和大白猪Clean Reads 均高于90%，错误的Reads 为0.02%；且从江香猪和大白猪的有效碱基数（Clean Bases）分别为6.43G 和6.18G，碱基质量大于20（Q20）占96% 以上，碱基质量大于30（Q30）占91% 以上，碱基G 和C 的数量占总碱基的54% 以上，说明获得的碱基质量较高。因此，测序结果可靠的可进行生物信息学分析。

表2 数据产出质量情况

2.2 差异表达基因筛选 皮尔逊相关系数（Pearson's Correlation Coefficient）R 是生物学重复相关性的重要评估指标之一，越接近1，则样品的相似度越高，相关性越好。在本实验中（图1），从江香猪和大白猪的为0.95，说明实验可靠，2 个猪种表达模式相似度高。

图1 从江香猪和大白猪背最长肌组织样品的皮尔逊相关分析

由图2 可知，通过筛选，从江香猪对比大白猪背最长肌共得到318 个DEGs，其中相对表达量显著上调的基因有184 个，显著下调的基因有134 个。

图2 差异表达基因火山图

表3 和表4 列举出了从江香猪与大白猪部分上调基因和下调基因，由于表中| log（FC）| ≥1，说明香猪与大白猪基因的相对表达量差异较大，均在2 倍以上。

表3 从江香猪中上调的DEGs（部分）

表4 从江香猪中下调的DEGs（部分）

2.3 差异基因GO 富集分析 将从江香猪和大白猪背最长肌中筛选的318 个DEGs 匹配到GO 功能注释数据库中，得到富集最显著（<0.05）的前30 个GO 条目（表5），其中生物过程（Biological Proceess）富集了27 个条目，细胞组分（Cellular Component）富集了3 个条目。推测大部分DEGs 在生物学过程有着重要的意义。在生物学过程中，从江香猪与大白猪的DEGs 主要富集在单个有机体代谢过程、丙酮酸代谢过程、羧酸代谢过程、脂肪酸代谢过程、肌肉系统过程、组织发育过程等；细胞组分主要包括细胞外空间、肌原纤维、细胞外基质等。

表5 从江香猪和大白猪差异表达基因GO 分析

2.4 差异基因KEGG 富集分析 如表6 所示，对从江香猪与大白猪318 个DEGs 进行KEGG 信号通路富集分析，共得到富集最显著的10 条通路（<0.05），包括与肉质相关的通路，分别是一磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路、转录因子信号通路、丙酮酸代谢途径、脂肪酸代谢途径等。

表6 从江香猪和大白猪差异表达基因KEGG 分析

2.5 qRT-PCR 验证DEGs 为验证从江香猪和大白猪测序结果，分别选择从江香猪差异高表达基因：干扰素诱导的跨膜蛋白1（）、神经丝中链（）、辅酶Q10A（）、丙酮酸脱氢酶激酶4（）、硫胺焦磷酸激酶1（）、动力蛋白轻链LC8-type1（）、硒结合蛋白1（），以及大白猪差异显著高表达基因：2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶1（）、分泌型磷蛋白1（）、具有序列相似性的家族134 成员B（）、胰岛素样生长因子结合蛋白5（）、肌球蛋白重链7（）、乙醇脱氢酶（）、硒蛋白W（）进行qRTPCR 验证。结果显示，从江香猪和大白猪差异高表达基因荧光定量的结果与RNA-seq 结果相似（图3、图4），表明转录组结果可靠性高。其中，在DEGs 比较研究中发现，同属硒蛋白家族的和基因在2 个猪种中具有不同的表达模式，在大白猪中高表达，而在从江香猪中高表达。

图3 从江香猪高表达基因

图4 大白猪高表达基因

3 讨 论

当前，转录组技术对猪肉品质的研究已获得很大的进展。成志敏等运用RNA-seq 技术研究大白猪和马身猪肌肉肉质性状相关候选基因时发现，肌球蛋白轻链3（）、肌球蛋白重链3（）、肌球蛋白重链6（）等基因均与肌纤维有关；李再磊等也基于转录组技术发掘和鉴定出了火毛撒坝猪和杜洛克猪背最长肌差异基因及相关信号通路。从江香猪是小型的地方猪种，由于贵州独特的喀斯特环境与气候，使从江香猪具有风味独特、肉质细嫩、营养丰富等优良特性。本研究基于成熟的RNA-seq 技术研究从江香猪和大白猪肉质差异基因，GO 分析的结果显示，从江香猪对比大白猪差异表达基因主要富集在生物过程和细胞组分，包括一元羧酸代谢过程、肌肉系统过程、组织发育过程、细胞外空间、肌原纤维、细胞外基质等。相关研究表明，肌肉系统过程、组织发育过程、应对脂质过程、肌原纤维和细胞外基质均与肌肉形成相关。此外，在KEGG 信号通路分析中，富集最显著的4 条信号通路（一磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路、转录因子信号通路、丙酮酸代谢途径以及脂肪酸代谢途径）均与肉质形成有关，这与前人研究一致。研究表明，AMPK信号通路是山东黑牛脂质代谢的主要代表通路。胰岛素和FoxO 信号通路在大白猪肉质性状中主要与葡萄糖代谢（葡萄糖转化为三磷酸腺苷（ATP）相关。进一步筛选差异高表达基因进行验证，发现基因在从江香猪背最长肌中高表达；基因在大白猪背最长肌中高达。

在从江香猪高表达基因中，与猪肌内脂肪、肌肉含水量显著相关，已被证实是从江香猪肌内前体脂肪细胞代谢的关键基因，在从江香猪背最长肌中表达量较高。和均是与疾病相关的基因。属于硒蛋白家族的一员，目前大量学者认为是体内的抑癌基因，其生理功能可能包括蛋白质降解、高尔基体内转运、细胞运动、细胞分化和氧化还原调节等。近年来研究发现，与脂肪细胞成熟分化有关，在脂肪细胞中作为细胞分化的内源性刺激物，且有助于硫化氢（HS）生物合成，是脂肪细胞分化和成熟的标志物。还有学者发现SBP1 是去泛素化酶1 的底物，在调节泛素化通路（泛素化通路与细胞的蛋白代谢紧密相连）中发挥一定作用。在大白猪差异高表达的基因中，参与早期肌肉细胞的增殖和分化，与猪肉品质的各个方面有关，尤其是pH 值。则被证实与牛背最长肌的肌内脂肪有关，与维生素A 的交互作用对牛肉大理石纹起着重要的影响。作为金华猪独特的甲基化基因，被验证在金华猪前脂肪细胞的整个成脂分化期发挥作用。是一种在补充硒的动物的肌肉中含量很高的蛋白质，但在缺硒或发生白肌病（White Muscle Disease，WMD）的动物中几乎检测不到。Li 等研究发现，日粮中添加酵母硒提高了猪只背最长肌中（即）基因的表达，其表达量与猪肉质的滴水损失呈负相关。以上研究结果提示，从江香猪肉质鲜嫩的原因多与肌内脂肪、脂肪细胞的代谢等因素有关。其中同属硒蛋白家族的和基因在肉质形成过程发挥重要生物学功能和肉质调控作用。

4 结 论

本研究基于转录组测序筛选从江香猪和大白猪背最长肌318 个DEGs，通过GO 和KEGG 分析发现，从江香猪和大白猪DEGs 主要集中在一磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路、转录因子信号通路、丙酮酸代谢途径以及脂肪酸代谢途径4 条与肉质相关的通路。进一步筛选得到影响2 个猪种肉质差异的关键候选基因：从江香猪高表达基因（）和大白猪中高表达基因（），其中同属硒蛋白家族的和基因在2 个猪种中具有重要生物学功能和肉质调控作用，可作为关注热点。本研究结果为猪肉品质的分子调控机制奠定了基础。