甲醛/二氧六环预处理慈竹制单糖及乳酸

马腾飞，战雅微，刘 悦，李志强

(国际竹藤中心；国家林业和草原局/北京市共建竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102)

随着塑料的使用范围越来越广，产生的塑料废弃物也越来越多，其中包装材料、农用材料、医用材料等占据绝大部分[1-2]。以乳酸为单体、经化学方法合成的聚乳酸是一种新型生物降解材料。乳酸是一种极具潜力和用途广泛的生物质衍生化学平台化合物。目前我国乳酸工业化生产主要采用玉米为原料，经粉碎、液化、水解、发酵生产乳酸[3]。虽然以玉米淀粉制备乳酸的技术已较为成熟，但是受国际环境变化及2020年新冠肺炎疫情影响，工业化生产乳酸势必要面临与人争粮的严重问题。以玉米秸秆、大豆秸秆、玉米芯、米糠和蔗渣等农林废弃物可制备乳酸，转化率一般在20%～80%，暂未见竹材制备乳酸相关报道[4-6]。近年来我国竹材加工利用产业正蓬勃发展，竹林面积达641.16 hm2，可为竹产业提供充足的原料[7]。而主要竹产品的竹材原料利用率分别为：竹家具30%、竹席45%～50%、竹地板20%～25%，在对竹材采伐及加工利用过程中会产生大量废竹[8]。因此，以竹材特别是竹材采伐和加工剩余物为原料制备液体燃料和化学品，是当前竹资源绿色可持续利用途径之一[9]。本研究以竹材为原料，通过甲醛/二氧六环溶液预处理来破坏竹材的抗降解屏障，提高纤维素转化为葡萄糖的得率，再利用水解液中的单糖发酵生产乳酸，以期为竹材及其加工剩余物制备聚乳酸可降解材料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

慈竹(BambusaemeiensisL.C.China & H.L.Fang)，两年生，采于广西壮族自治区崇左市江州区驮卢镇。将竹材劈成竹条并烘干后，经高速粉碎机粉碎，取粒径0.25～0.38 mm的慈竹粉末备用。

1，4-二氧杂环己烷(二氧六环)、盐酸、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CaCO3、蛋白胨、甲醛和乳酸等，均为市售分析纯。纤维素酶(C1794-5KU)，Sigma公司；β-葡萄糖苷酶，诺维信(中国)投资有限公司；乳酸菌酸奶发酵剂(4 g/L，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌)，北京川秀科技有限公司。

KYC-100C恒温摇床；Metrohm 850离子色谱仪，瑞士万通(中国)有限公司；100 mL水热合成反应釜；YZJXFQ-6均相反应器；Quanta 200HV高分辨场发射环境扫描电镜(SEM)，PHILIPS公司；X PERTPRO X射线衍射(XRD)仪，Panalytical公司；SBA-40E型葡萄糖-乳酸生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所。

1.2 甲醛/二氧六环预处理竹材

称取1.25 g竹粉，置于100 mL水热合成反应釜中，依次加入45 mL二氧六环、2.1 mL盐酸(或1.1 mL硫酸)和3～5 mL的甲醛试剂。将水热合成反应釜置于均相反应器中，在温度80 ℃，旋转速率为20 r/min的条件下，预处理8 h。不加入甲醛的样品在相同的条件下反应，作为对照样。

预处理结束后，反应釜自然冷却至室温，打开密闭反应釜，使用真空泵、砂芯过滤装置和45 μm孔径有机系微孔过滤膜进行固液分离。向过滤后所得废液中加入去离子水以析出木质素沉淀，所得的滤液存于4 ℃ 冰箱中用于滤液化学成分分析。固体样品先用25 mL二氧六环洗涤至淡黄色，以冲洗去除残留的甲醛和盐酸，再用去离子水对其洗涤直至洗涤水为无色，除去残留的二氧六环。预处理得到的固体样品取部分在103 ℃烘箱中烘干测量含水率，其余部分保存于4 ℃冰箱中用于化学成分分析和酶水解。每个预处理条件均进行3次试验，结果记为平均值±标准差(SD)。

1.3 预处理后样品酶水解

以预处理后得到的固体样品用于酶水解实验，在50 mL三角瓶中进行，底物添加量为20 g/L，添加到20 mL pH值为4.8的乙酸/乙酸钠缓冲溶液中，酶用量为纤维素酶10 FPU/g(以底物质量计，下同)、β-葡萄糖苷酶30 IU/g(以底物质量计，下同)。酶解温度为50 ℃，转速为200 r/min，酶解时间为24 h，未经预处理的竹粉原料作为空白对照。为了提高酶水解后葡萄糖的得率，对竹材预处理条件进行了优化，将1.2节的2.1 mL盐酸换成1.1 mL硫酸，酶解条件同时优化为纤维素酶用量20 FPU/g、β-葡萄糖苷酶30 IU/g，酶解时间48 h。

1.4 酶水解液发酵产乳酸

将酶水解液置于高压灭菌锅中灭菌1 h，取出待其自然冷却后，再加入1 mL营养盐、0.3 g/L KH2PO4、5 g/L(NH4)2SO4、0.75 g/L MgSO4·7H2O、0.2 g/L ZnSO4·7H2O、10 g/L CaCO3、3.5 g/L蛋白胨。以NaHCO3调节酶解液至pH值为6.8，按酶水解液中葡萄糖质量的3%接种量接入乳酸菌，在42 ℃、200 r/min 的条件下恒温振荡发酵24 h。

1.5 分析方法

1.5.1化学组分分析 原料慈竹和预处理固体样品的纤维素、半纤维素含量按照美国国家可再生能源实验室(NREL)推荐的方法测定[10]。

1.5.2SEM分析 预处理后固体样品的表面形貌，采用Quanta 200HV高分辨场发射环境SEM进行观察，放大倍数为500倍。

1.5.3XRD分析 预处理后固体样品结晶度使用XRD仪分析，Cu靶Kα辐射(40 kV，40 mA)，谱图范围(2θ)为5～45 °，扫描速率为5(°)/min。每个样品的相对结晶度(ICr)按Segal提出的经验公式进行计算：

式中：I002—晶格衍射极大强度；I15.8°—无定形区背景散射强度。

1.5.4乳酸质量浓度测定 乳酸采用SBA-40E型葡萄糖-乳酸生物传感分析仪测定，该仪器以固定化酶为关键元件，配备两支生物探测电极，可以在20 s内得到葡萄糖及乳酸的定量分析结果，乳酸的最大检出限为0.5 g/L。

2 结果与分析

2.1 预处理对竹材化学组成的影响

预处理是竹材生物转化制取液体燃料及化学品过程中一个关键且高成本的步骤。表1列出了甲醛/二氧六环溶液中甲醛用量对预处理后固体样品化学组成的影响。由表1可知，固体样品得率在51.7%～55.3%之间。酸性二氧六环预处理可以脱除半纤维素和部分木质素，从而提高了固体样品中纤维素的含量。而添加不同体积的甲醛对预处理后固体样品收率影响不大，原因是在预处理过程中甲醛不参与脱除半纤维素和木质素，其主要与降解木质素发生接枝反应，减少木质素降解物再次发生团聚而影响后续酶水解效率。添加甲醛可以保留木质素的反应活性[9]，为后续研发木质素衍生产品打基础。当甲醛添加量增加时，固体样品中纤维素的含量会降低。从固体样品中纤维素、半纤维素和木质素三者之和来看，随着甲醛量的加大，总含量就越小。原因可能是甲醛用量的增大导致二氧六环预处理效果降低，从而使底物中的木质素与甲醛的接枝反应产物含量增加。

表1 甲醛用量对竹材固体样品化学组成的影响1)

在对所有预处理废液进行糖分分析后，发现废液中的木糖含量可以忽略不计，说明在预处理过程中，半纤维素几乎全部被降解了。这可能是由于二氧六环和HCl将半纤维素降解，与预处理溶剂中是否添加甲醛关系不大。

2.2 固体样品分析

2.2.1SEM分析 图1为竹材及其预处理固体样品的SEM照片。由图1(a)可知，未处理的竹粉表面尚有一层蜡质。蜡质层会阻碍纤维素对酶的吸附能力，从而降低酶水解效率[11]。而使用二氧六环作为有机溶剂的预处理可将竹材中大部分蜡质溶解脱除，使酶与纤维素的可及度大幅增加，从而提高了酶水解葡萄糖得率。由图1(b)可以发现，预处理底物不再成纤维束状且结构疏松，表明木质素脱除提高了孔隙率，增大反应可及性和底物比表面积。然而，伴随甲醛添加量的逐步增大，预处理底物表面的纤维更加致密，反应可及性和比表面积减小，以至于酶不能轻易到达竹材内部进行酶水解反应；其表面纤维卷曲程度也逐渐变小，说明甲醛的添加对木质素和纤维素宏观结构均起到了保护作用。

a.未处理竹材untreated bamboo；b.0 mL；c.3 mL；d.4 mL；e.4.5 mL；f.5 mL

2.2.2XRD分析 图2为未处理竹材及添加不同体积甲醛预处理样品的XRD图。谱图中各峰高均由同方向排列的晶面分布数量决定，样品晶粒为同方向排列的峰高要大于样品晶粒无规律排列的峰高；半峰宽由晶粒大小决定，峰宽值越小，晶粒越大。由图可见，竹纤维的XRD衍射峰位出现在2θ为15.8°、22°、34°，为天然纤维素的特征峰[12]。样品峰高随着甲醛添加量的减少而增高，也证实了预处理底物纤维素含量是在增加的；峰宽变化不大，可忽略不计，表明预处理对结晶区晶粒尺寸影响较小。

a.未处理竹材untreated bamboo；b.0 mL；c.3 mL；d.4 mL；e.4.5 mL；f.5 mL

未处理竹材的结晶度为49.0%，而甲醛添加量为0、3.0、4.0、4.5、5.0 mL时，底物纤维素的结晶度分别为55.5%、56.7%、55.4%、53.5%和50.5%。可以看出，在甲醛添加量为5.0 mL时，底物中纤维素含量为未处理竹材的1.9倍，但结晶度却只是稍大于未处理竹材。原因可能是在脱除木质素的同时，甲醛对底物纤维素无定形区乃至结晶区也起到了破坏降解作用。随着甲醛添加量的减少，底物的结晶度随之增大，这可以说明底物纤维素含量提高的同时，预处理对底物纤维素无定形区的降解作用也在加剧。

2.3 预处理对酶水解的影响

以预处理后固体样品为底物，在纤维素酶用量10 FPU/g、酶水解时间24 h时的酶水解结果如表2所示(总糖得率即水解后六碳糖和五碳糖的得率之和)。由表2可得，不添加甲醛的预处理还原糖得率高达94.0%，葡萄率得率33.2%，均高于添加甲醛的预处理底物的酶解效果。这表明不添加甲醛的预处理过程中大部分木质素及半纤维素被脱除，从而提高了底物纤维素含量，有助于酶水解反应的进行。

表2 预处理底物的酶水解性能

甲醛的加入会增大底物中木质素的含量，导致预处理底物难以被酶水解。在酸性少水的环境中，甲醛与木质素侧链发生缩醛反应，阻止了苄基阳离子的形成；其次，被质子化的甲醛进攻芳香环甲氧基的对位或邻位，通过亲电芳香取代形成羟甲基结构，从而使这些反应性位置被稳定下来[13]。以二氧六环为溶剂，甲醛为主要化学添加剂的化学预处理过程中，甲醛可以对木质素起到保护作用，但也间接的保护了纤维素，导致预处理底物的酶水解效率低下。但甲醛保留了木质素的活性，对后续研发高附加值木质素衍生产品有重要意义。竹材综纤维素可水解生成单糖进而发酵生产乳酸，加上活性木质素用于研发高附加值衍生产品，从而可实现竹材的全组分利用[14-15]。

2.4 底物酶水解液发酵产乳酸

采用优化后的预处理的酸和甲醛添加量(表3)，在其他预处理条件不变的情况下得到预处理的固体样品；再将底物用于酶水解，酶水解过程的酶用量为纤维素酶20 FPU/g和β-葡萄糖苷酶30 IU/g，酶水解时间48 h；酶水解液用于发酵生产乳酸，结果如表3所示。

表3 竹材酶水解液发酵产乳酸的预处理条件及结果

从表3中可以看到，纤维素酶增加为20 FPU/g(以底物质量计)后，不添加甲醛的底物酶水解葡萄糖得率有了显著的提高，最高可达92.8%，但样品2和4的乳酸得率却不高。相比较样品2和4，样品1和3因为添加甲醛的缘故，酶水解产葡萄糖得率不高，但乳酸得率却较高，原因可能是其葡萄糖浓度较低对乳酸菌的反馈抑制作用较弱或是由于酶水解液中葡萄糖浓度低以及葡萄糖-乳酸生物传感分析仪的检测精度较低的原因。

与添加盐酸的预处理相比，添加硫酸的预处理底物的乳酸得率较高，样品4比样品2的乳酸得率高12.2个百分点，主要是因为稀硫酸处理能降低底物纤维素的平均聚合度，形成多孔或溶胀型的结构，增大反应能力，有益于乳酸菌的发酵[16]。发酵结束后，还测定了发酵液中残留的糖含量，结果发现残留的糖可以忽略不计，表明糖类已经完全转化消耗掉了。但纵观4个样品的乳酸得率均偏低，究其原因可能是水解发酵液中葡萄糖含量不高，在发酵过程中很大一部分可能作为营养物质被乳酸菌消耗了，也可能与乳酸菌活力及营养盐配置有关。同时，对比样品1和样品2，及样品3和样品4可得出，添加甲醛的预处理样品酶水解性能普遍降低，但酶水解液发酵后乳酸的得率增高。进一步表明，甲醛的添加对纤维素酶酶解有抑制作用，而对乳酸菌发酵有促进作用。未来可从微生物学角度来开展进一步研究，从而探索出竹材制备乳酸的最佳工艺路线。

3 结 论

3.1酸性甲醛/1,4-二氧六环溶液预处理竹材可以脱除半纤维素和木质素，大幅提高固体样品中纤维素的质量分数至75.6%～90.7%。

3.2预处理后底物在纤维素酶用量20 FPU/g、β-葡萄糖苷酶用量30 IU/g和酶解时间48 h条件下，酶水解后纤维素转化为葡萄糖的最高得率为92.8%；酶水解液可以直接用于发酵生产乳酸，葡萄糖转化为乳酸的得率最高可达73.2%。

3.3甲醛/1,4-二氧六环溶液预处理过程可使竹材表面蜡质层几乎完全被溶解脱除，得到的底物结构变得疏松，从而有效提高了竹材纤维素酶解和发酵效率。