黄瓜硫酸盐转运蛋白家族成员的鉴定与表达分析

赵 闻，廖伟民，赵金栋，刁慧贞，江孟涛，蒋伦伟

（江西农业大学生物科学与工程学院，南昌 330045）

硫（sulfur）作为植物体中所需的6种大量元素之一，是硫胺素、甲硫氨酸、半胱氨酸、铁氧化还原蛋白、生物素等有机物的重要组成部分，广泛参与植物的生长发育过程。硫酸盐（SO42-）是土壤中硫营养的主要存在形式，根系从土壤环境中吸收SO42-的能力是影响植物硫素营养状况的重要因素之一。植物体内的硫以无机硫酸盐和有机硫化合物的形式存在。其中SO42-主要贮藏在液泡中，有机态硫则主要以含硫氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸及谷胱甘肽等化合物存在于植物体内的各器官中。

大量研究发现，无论是植物从土壤中吸收硫，还是SO42-在细胞内的运输都离不开硫酸盐转运（sulfate transporter，SULTR）蛋白。SULTR蛋白的C端具有抗σ因子拮抗（sulfate transport anti-sigma，STAS）结构域，N端具有硫转运结构域，同时还包含12个跨膜结构域（transmembrane domains，TMDs）［1］。SULTR基因通常是以家族的形式存在于不同植物中的，迄今为止已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）［2］、高粱（Sorghum bicolor）［3］、小麦（Triticum aestivum）［4］、苹果（Malus domestica）［5］、山黧豆（Lathyrus sativus）［6］、茶树（Camellia sinensis）［7］等植物中得到鉴定。拟南芥SULTR基因家族共有12个成员，根据其亚细胞定位、序列同源性及功能特性可分为4个亚家族（SULTR1～4），分别负责不同组织和胞内SO42-的转运。它们在不同的组织中以不同水平表达，其亲和力和表达方式的差异体现了它们各自在功能上的差异。其中，高亲和力的SULTR一般在根部特异性表达，主要负责吸收土壤中的硫；低亲和力的SULTR主要在叶片中表达，负责调节植物细胞间硫的转运。如在低硫胁迫时，AtSULTR1;1和AtSULTR1;2能促使硫酸盐进入根；其中AtSULTR1;2是主要的硫酸盐吸收者，At-SULTR1;2基因的缺失会导致大幅降低植物硫酸盐的吸收，而AtSULTR1;1仅在低硫条件下表达，从而辅助AtSULTR1;2增强植物对硫酸盐的吸收［8］。At-SULTR1;3则位于韧皮部，参与硫酸盐从地上部分向根部的转运；而AtSULTR3;5可以促进硫酸盐由根系到地上部分的运输［9］；AtSULTR4;1和AtSULTR4;2定位于液泡膜，在低硫环境胁迫下可以通过把液泡中的SO42-释放到维管组织中来调节根系组织液泡的硫贮存能力［10］。除SO42-的转运外，一些SULTR蛋白还参与硒酸盐的转运，其表达受硒酸盐和硫酸盐的调控［11-12］。如茶树CsSULTR3.5基因在短时间内能够快速响应硫酸盐的诱导，而硒酸盐需要较长时间才能诱导其表达［11］。此外，SULTR蛋白还广泛参与植物的胁迫应答过程，如重金属［3］、低温［13］、干旱、盐等非生物胁迫［14-16］。如在镉胁迫下，高粱SbSULTR1;2、SbSULTR1;3、SbSULTR3;3、Sb-SULTR3;5，以及拟南芥AtSULTR1;1、AtSULTR1;2、AtSULTR1;3、AtSULTR2;1、AtSULTR2;2等基因的表达量明显上调［3］。AtSULTR3;1的缺失影响了脱落酸（abscisic acid，ABA）的合成，从而改变了植株在种子萌发和根系生长阶段对于外源ABA的响应［16］。

黄瓜是一年蔓生植物，因富含维生素、糖类、胡萝卜素、铁等营养成分以及其种植简单的特性在世界各地被广泛种植，是一种重要的经济农作物。霜霉病是黄瓜生产中的重要病害之一，它是由古巴假霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis）侵染所引起的一种叶部病害，严重时会导致黄瓜大面积枯死，造成严重的经济损失。SULTR基因作为硫酸盐吸收和转运过程中的关键基因，在含硫营养代谢以及胁迫应答中发挥着重要的作用。但是迄今为止，黄瓜SULTR基因家族成员尚未被鉴定。本研究利用生物信息学的方法和相关软件鉴定黄瓜SULTR基因家族成员，并对该基因家族的组成、结构、进化关系、保守性、编码蛋白及表达模式进行分析，为将来探究该家族基因潜在的生物学功能提供参考，为探究黄瓜硫的同化及霜霉病的抗性机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 黄瓜SULTR基因家族的全基因组鉴定

从NCBI下载12条拟南芥SULTR蛋白作为参考序列，在黄瓜基因组网站（http://cucurbitgenomics.org/organism/2）进行BLAST，e值设置为0.01；同时，在PFAM数据库（http://pfam.xfam.org/）中下载基因的HMM（Hidden Markov Model）种子文件（PF00916和PF01740），运用HMMER v3.0软件对黄瓜v2蛋白数据库进行扫描。整理BLAST与HMMER结果，除去冗余基因，并通过PFAM和SMRAT网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）鉴定候选序列是否同时具有SULTR蛋白的两个特征结构域，最后符合条件的被列为黄瓜SULTR基因家族成员。

1.2 黄瓜SULTR基因染色体定位与蛋白理化性质分析

在黄瓜基因组网站中提取黄瓜SULTR基因的染色体位置信息和蛋白序列，通过ExPASy数据库（http://web.expasy.org/）预测黄瓜SULTR蛋白的亲疏水性均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）、等电点（isoelectric point，pI）、相对分子质量（molecular weight，MW）和氨基酸数目。通过Plant-mPLoc数据库（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）预测黄瓜SULTR蛋白的亚细胞定位。

1.3 黄瓜SULTR家族成员蛋白系统进化树分析

参考之前的文献［17］，使用MAFFT在线服务器（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）对拟南芥和黄瓜2个物种SULTR基因家族的蛋白序列进行比对，构建系统发育树，并利用MEGA7.0软件对系统发育树进行可视化分析。

1.4 黄瓜SULTR基因结构及启动子顺式作用元件分析

利用 Gene Structure Display Server服务器（GSDS，http://gsds.gao-lab.org/）对黄瓜SULTR基因的编码序列（coding sequence，CDS）和基因组序列（genomic DNA，gDNA）进行比对，分析CsaSULTR基因中CDS、非编码区（untranslated region，UTR）与内含子的结构分布。在PlantCARE数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上提交黄瓜SULTR基因起始密码子（ATG）上游2 000 bp启动子序列，分析启动子区域中与生长发育、逆境胁迫以及激素应答相关的顺式作用元件。

1.5 黄瓜SULTR基因表达分析

在NCBI网站中下载黄瓜不同组织（包括根、茎、叶、雄花、雌花、卷须、子房等，编号PRJNA80169）和霜霉病处理不同时期（编号PRJNA285071）的RNA-seq数据［18-19］，根据前人的文献进行数据化处理，并以TPM（transcripts per million）值进行可视化［17，20］。

2 结果与分析

2.1 CsaSULTR基因的全基因组鉴定及染色体定位

基于黄瓜v2蛋白数据，利用HMMER软件比对搜索种子文件（PF00916和PF01740），同时利用已发表的拟南芥SULTR序列，对黄瓜v2蛋白数据进行检索，进一步通过保守结构域分析，最终鉴定获得10个黄瓜SULTR基因家族成员。根据这10个基因及与拟南芥SULTR基因的亲缘关系将它们命名为CsaSULTR1;1～CsaSULTR4;1（表1）。这些基因不均等分布在黄瓜的3号、4号、5号、7号染色体上，其中5号染色体上含有的CsaSULTR基因最多（共4个），3号染色体上分布的CsaSULTR基因最少（共1个）。对CsaSULTR基因序列分析发现，Csa-SULTR3;3的gDNA最长（10 307 bp），CsaSULTR1;2的gDNA长度最短（4 189 bp）（表1）。

2.2 黄瓜SULTR蛋白理化性质分析

通过分析蛋白的理化性质发现，黄瓜SULTR蛋白相对分子质量在70.93（CsaSULTR2;1和CsaSULTR3;2）～76.69 kD（CsaSULTR4;1）之间，pI在8.48（CsaSULTR3;2）～9.30（CsaSULTR2;1）之间。亚细胞定位预测表明，除CsaSULTR4;1定位于叶绿体外，其他CsaSULTR蛋白全部定位于细胞膜上（表1）。

表1 黄瓜SULTR家族成员基本信息Tab. 1 Basic information of the SULTR gene family in cucumber

2.3 黄瓜SULTR基因家族成员系统发育分析与分类

进化树分析表明，拟南芥和黄瓜SULTR蛋白可分为4组（GROUP 1～4）：第1组中包含3个Csa-SULTR成员（CsaSULTR1;1、CsaSULTR1;2、CsaSUL-TR1;3）；第2组包含2个CsaSULTR成员（CsaSULTR2;1、CsaSULTR2;2）；第3组包含4个CsaSULTR成员（CsaSULTR3;1、CsaSULTR3;2、CsaSULTR3;3、Csa-SULTR3;4）；第4组包含1个CsaSULTR成员（Csa-SULTR4;1）（图1）。此聚类结果与拟南芥、水稻、高粱、玉米等物种一致［3，14］。

图1 拟南芥与黄瓜SULTR家族成员的系统进化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of SULTR family members from Arabidopsis and cucumber

2.4 黄瓜SULTR家族成员基因结构分析

基因结构分析结果表明，CsaSULTR基因均含有较多数量的内含子（图2）。其中CsaSULTR1;1含有9个内含子，其余的CsaSULTR基因包含10～16个数量不等的内含子。此外，属于同一组的CsaSULTR基因含有相似的基因结构，与系统发育分析的结果一致。如CsaSULTR3;1和CsaSULTR3;2内含子的数量分别都为11个，而且每个外显子的长度都非常相似。

图2 黄瓜SULTR家族成员基因的结构分析Fig. 2 Gene structure analysis of SULTR family members in cucumber

2.5 黄瓜SULTR基因启动子顺式作用元件分析

为了对SULTR基因的转录调控进行深入的了解，本文利用PlantCARE数据库对10个CsaSULTRs上游2 000 bp位点内的激素反应与胁迫应答元件进行了分析，结果如图3所示。在激素反应元件中，ABA 响应元件（abscisic acid responsive element，ABRE）含量最多，每一个CsaSULTR基因的启动子中均含有不同数量的ABRE元件。在胁迫应答元件中，抗厌氧元件（anaerobic induction element，ARE）的基因数目含量最多，分布在除CsaSULTR2;2和Csa-SULTR3;2外的其他CsaSULTR基因中。这些结果表明，CsaSULTR基因可能在黄瓜的生长发育、激素应答及胁迫应答过程中具有重要功能。

图3 黄瓜SULTR基因顺式作用元件分析Fig. 3 Cis-acting elements in the promoters of each SULTR gene in cucumber

2.6 黄瓜SULTR基因在不同组织下的表达模式分析

利用TBtools软件，基于现有的RNA-seq数据绘制黄瓜CsaSULTR基因在根、茎、叶、雄花、雌花、卷须、子房等7个不同组织的表达模式热图，结果如图4所示。CsaSULTR1;1和CsaSULTR1;3在各组织中的表达量都非常低，甚至不表达，其余基因至少在一个组织中存在高表达。其中CsaSULTR2;2在雌花中高表达，而在茎中却检测不到表达；CsaSULTR3;1基因在根、雄花、雌花和子房中表达最高；CsaSULTR1;2和CsaSULTR2;1基因在雄花中表达最高；CsaSULTR3;4在根和雄花中表达最高。不同的CsaSULTR基因的表达量与表达模式不尽相同，表明黄瓜SULTR基因的功能存在着组织特异性。

图4 黄瓜CsaSULTR基因的组织表达谱Fig. 4 Tissue expression profiles of cucumber CsaSULTR genes

2.7 黄瓜SULTR基因在霜霉病菌侵染下的表达分析

为了确定黄瓜SULTR基因的表达是否受到霜霉病菌侵染的响应，本文利用前人发表的RNA-seq数据［18］，在霜霉病菌侵染不同时间点的PI 197088（霜霉病高抗品种）和Vlaspik（霜霉病高感品种）中对CsaSULTR基因的表达量进行了分析（图5）。结果表明，在霜霉病菌侵染后的Vlaspik中，Csa-SULTR1;2、CsaSULTR2;1、CsaSULTR2;2、CsaSULTR3;1、CsaSULTR3;3的表达量明显呈下降趋势，而CsaSULTR3;4和CsaSULTR4;1表达量明显上升。在PI 197088中，CsaSULTR3;2、CsaSULTR4;1、Csa-SULTR1;2、CsaSULTR2;2接种霜霉病菌后的表达量均呈上升趋势，而CsaSULTR3;1、CsaSULTR3;3、CsaSULTR2;2接种霜霉病菌1 d后的表达量明显下降，随后上调表达或恢复至对照水平。

图5 黄瓜CsaSULTR基因在霜霉病菌侵染胁迫下的表达模式Fig. 5 Expression pattern of cucumber CsaSULTR genes during Pseudoperonospora cubensis infection

3 讨论

SULTR蛋白在植物吸收土壤中硫的过程中发挥着重要的作用。近年来，许多SULTR基因已经在各种植物物种中被相继报道。如拟南芥和水稻中被报道各有12个SULTR基因［5］，高粱中有11个［3］，小麦中有10个［4］，苹果中有9个［5］，茶树中有8个［7］。本研究利用生物信息学方法在黄瓜中共鉴定得到了10个CsaSULTR基因，它们不均等地分布在4条染色体上。理化性质结果表明，所有CsaSULTR蛋白的pI值都大于7，表明它们均呈碱性，与茶树、土豆、高粱等物种的研究相一致，表明CsaSULTR蛋白与其他物种一样，需要在碱性条件下才能发挥其对硫的吸收转运等功能。此外，绝大部分CsaSULTR蛋白均定位于质膜上，故可推测这些CsaSULTR蛋白可能在质膜中发挥其转运功能，这与先前报道的茶树［3］、高粱［7］等物种SULTR蛋白主要定位于质膜上相同，表明SULTR蛋白在不同物种间具有相似或相同的功能。此外，亚细胞定位预测结果表明，CsaSULTR4;1定位于叶绿体上，暗示其可能负责转运硫酸盐到叶绿体，参与叶绿体硫酸盐的代谢。

通过对拟南芥和黄瓜的系统发育树分析，上述CsaSULTR成员可分为GROUP 1～4四组，且亲缘关系较近的CsaSULTR成员的基因结构非常相似。这些结果与先前报道的拟南芥、茶树、玉米等的SULTR基因家族一致［7，15］。此外，CsaSULTR基因的启动子分析显示，这10个CsaSULTR基因的上游区存在较多的激素响应和胁迫应答等多种顺式作用元件。需要特别指出的是，植物激素同样能调节硫营养的运输和同化代谢过程。如硫酸盐及其同化产物Cys可以影响ABA合成途径中关键酶ABSCISIC ALDEHYDE OXIDASE 3（AAO3，EC 1.2.3.1）的活性，从而调节ABA的生物合成［16，21］。所有CsaSULTR基因对ABA的响应元件数量居多，表明CsaSULTR基因在黄瓜ABA合成过程中可能有着较为重要的作用。在胁迫应答方面，除Csa-SULTR3;2外，其余CsaSULTR基因中均包含数量不等的胁迫应答响应元件，表明它们可能在胁迫应答过程中发挥一定的作用。之前在玉米中的研究表明，除ZmSULTR3;3外，其余ZmSULTR基因均能够响应干旱、高盐和高温等非生物胁迫［15］。当土壤中含硫量较低时，在大豆中过表达GmSULTR1;2b基因能增强大豆对缺硫胁迫的耐受性，从而提高作物的产量［22］。

对黄瓜SULTR基因的组织表达模式分析表明，SULTR基因在黄瓜中具有组织特异性。例如：Csa-SULTR2;2不在茎中表达，可能不参与茎中硫元素的运输传递；CsaSULTR3;1、CsaSULTR3;4在根、雄花、雌花和子房中表达量最高，表明两者在黄瓜的花房发育过程中发挥着重要的作用。这与之前报道的一些物种的SULTR基因表达模式相同。例如：拟南芥AtSULTR1亚家族主要在根系中表达，负责在根部于外界环境中摄取转运硫酸盐［8］；AtSULTR2亚家族主要在维管组织中表达，负责组织间硫的分布［23］。茶树中除CsSULTR1;1和CsSULTR3;2外，其余6个CsSULTR基因在处于休眠期的茎中高量表达［7］。大豆的SULTR1;2b基因与油菜的SULTR2;2基因在根中特异性表达［24］。最近的研究表明，谷子SiSULTR2.1也具有组织表达特异性，且在谷子茎、叶片中表达量较高［25］。此外，在亲缘关系相近的一些CsaSULTR之间，基因表达量也较为相似。例如：CsaSULTR1;1与CsaSULTR1;3在各组织中都低量表达或不表达；CsaSULTR2;1与CsaSULTR1;2都在雄花中表达量最高，在卷须中表达量最低；CsaSULTR3;1与CsaSULTR3;4都在根中表达量最高，在卷须中表达量最低（图4）。而第3亚家族和第4亚家族的CsaSULTR成员基因表达量相对于第1亚家族和第2亚家族要高出许多，具有明显的差异，且亲缘关系相近的基因结构也较为相似（图2）。这些结果表明，亲缘关系相近的CsaSULTR基因可能在黄瓜的同一组织中具有相似的硫转运功能，同时，它们可能在黄瓜对SO42-吸收转运的不同环节与过程中发挥作用。

硫营养与激素之间的信息交流是与环境胁迫的响应等交织在一起的，是植物对营养和其他环境胁迫适应所作出的自我调节的反应。大部分CsaSULTR基因启动子的上游区存在较多的ARE以及水杨酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）相关的顺式作用元件，暗示CsaSULTR基因可能参与生物胁迫响应。本研究在霜霉病高抗品种PI 197088和霜霉病高感品种Vlaspik中对CsaSULTR基因响应霜霉病菌诱导的表达变化进行了对比分析，结果表明，仅有CsaSULTR4;1在两个品种中均表现出上调表达，特别是在病原菌处理早期（2 dpi）。而Csa-SULTR3;1、CsaSULTR3;3、CsaSULTR2;2在两个品种中均表现出下调表达，但它们的表达量在高感品种接种霜霉病菌1～7 d后均呈下调趋势，而在高抗品种中仅在病原菌处理早期（1 dpi）明显下降，随后上调表达或恢复至对照水平。此外，CsaSULTR2;1、CsaSULTR1;2仅在高感品种中表现出明显的下调表达，而CsaSULTR3;2和CsaSULTR3;4分别仅在高抗品种和高感品种中表现出明显的上调表达。这些结果表明，CsaSULTR基因可能在黄瓜抵御霜霉病菌侵染过程中发挥了重要的作用。