HEK293T细胞中NLRP3炎性小体活化体系的构建

罗 玲，赵 锴

（中南大学湘雅三医院血液科，长沙 410013）

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性小体是一类存在于巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等免疫细胞胞浆中的多聚蛋白复合体，由NLRP3、凋亡相关点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC ）和胱冬肽酶-1（Cas-pase-1）三种蛋白组成［1-3］。NLRP3炎性小体作为天然免疫系统重要的组成部分［4-5］，在多种生理、病理过程中发挥着关键作用，可被入侵机体的病原微生物，如病毒、细菌、真菌等活化，同时也对损伤细胞释放出来的自身物质（如脂肪酸、ATP）和环境中的颗粒（如二氧化硅颗粒）等产生应答。该复合体活化后可通过Caspase-1诱导促炎细胞因子白细胞介素1β前体（pro-IL-1β）和白介素18前体（pro-IL-18）的成熟和分泌，同时激活打孔蛋白消皮素D（gasdermin D，GSDMD），促使GSDMD释放出活性N端蛋白，随后聚集在细胞膜上造成细胞膜孔形成，从而引起细胞焦亡［6-7］。研究表明，NLRP3炎性小体的异常活化与关节炎、脓毒症、痛风、硅肺、阿尓茨海默病、2型糖尿病、肥胖等急慢性炎症疾病以及自身免疫性疾病密切相关［8-10］，因此，NLRP3炎性小体的活化调节机制以及靶向药物开发一直是本领域关注的前沿热点。

目前已有不少研究者提供了NLRP3炎性小体活化的研究方法，其中在HEK293T细胞中重建NLRP3炎性小体活化体系是一种简便可行的方法［11-12］。由于HEK293T细胞中不表达NLRP3炎性小体组分，故转染过表达该组分可以促使NLRP3炎性小体组装并活化［11-12］。该重建方法为研究NLRP3炎性小体活化的调控机制（如蛋白间相互作用、翻译后修饰［13-15］等）以及相关药物的筛选提供了一个简化的研究平台。本研究旨在建立一种HEK293T细胞NLRP3炎性小体活化体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与质粒

HEK293T细胞冻存于本实验室，原购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。

质粒pcDNA3.1（-）B-Flag-pro-IL-1β、pcDNA3.1（-）B-Flag-pro-Caspase-1、pcDNA3.1（-）B-Flag-ASC、pcDNA3.1（-）B-Myc-NLRP3为本实验室常规构建［16］。

1.1.2 试剂耗材与仪器

试剂耗材有胎牛血清（Gibco）、培养基Dulbecco改良 Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（Gibco）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Trypsin-EDTA solution，0.25%）（Thermo fisher）、Nigericin（invivogen）、转染试剂Linear Polyethylenimine 25000（Polysciences）、改良的 Minimal Essential Medium减血清培养基（Opti-MEM）（Gibco）、Anti-IL-1β抗体（RD systems）、Anti-β-actin抗体（Cell Signaling Technology）、Anti-Flag-tag（Cell Signaling Technology）、Anti-Myc-tag（Cell Signaling Technol ogy）、细胞裂解液（Cell Lysis Buffer，CLB）（Cell signaling Technology）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（Thermo fisher）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）试剂盒（eBioscience）。仪器有37℃恒温培养箱（Thermo fisher）、离心机（eppendorf）、洗脱摇床（江苏荣华仪器制造有限公司）、酶标仪（Thermo Scientific）和ChemiDoc高灵敏度化学发光成像仪（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 HEK293T细胞培养

用DMEM完全培养基（DMEM培养液中添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素）培养HEK293T细胞。于37℃、5% CO2恒温培养箱中进行孵育，待细胞密度长至80%～90%后，经0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃下消化3 min后，加入1 mL 293T细胞培养基停止消化过程，再以800 r/min离心细胞悬液5 min。重悬细胞并计数后，将293T细胞接种于细胞培养皿（24 孔板：4×105个/孔）中过夜，待细胞密度达到70%～80%时准备转染工作。

1.2.2 质粒转染

在 1.5 mL Eppendorf中混匀质粒 pro-IL-1β（每孔200 ng）、pro-Caspase-1（每孔100 ng）、ASC（每孔20 ng）、NLRP3（每孔100 ng）与Opti-MEM培基（每孔 50 μL）。在另一个 1.5 mL Eppendorf管中混匀Opti-MEM培养基（每孔50 μL）与Linear Polyethylenimine 25000转染试剂。转染试剂按照3 μL转染试剂对应1 μg质粒的比例加入。再将稀释的质粒和稀释的转染试剂混合在一起，室温下静置15～20 min。将质粒与转染试剂混合物逐滴滴入细胞中，并轻轻摇动细胞板，以避免局部出现高浓度转染物，影响细胞活力。转染24 h后，收集细胞蛋白用于Western blot检测，或者用250 μL DMEM完全培养基替换原培养基继续培养，6 h后，加入10 μmol/L Nigericin，刺激1 h，收集细胞上清，2 000 r/min离心5 min去除细胞残渣和碎屑，取50 μL利用ELISA检测IL-1β的量。

1.2.3 Western blot检测

将转染处理后的细胞加入预冷的裂解液（CLB细胞裂解液、100 ×蛋白酶抑制剂PMSF和100 ×蛋白酶抑制剂cocktail）中收取蛋白样本，BCA法测定蛋白浓度，将各蛋白样品调整至等质量，加入5 ×上样缓冲液后，100℃煮10 min使蛋白变性。12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）上样，电泳分离蛋白质，再在260 mA稳流中将蛋白转至聚偏二氟乙烯［poly（vinylidene fluoride），PVDF］膜上，5%脱脂牛奶室温封闭膜1 h后，一抗于4℃孵育过夜。TBST（50 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl和0.1% Tween-20配制而成）液洗膜3遍，每次10 min，再用对应二抗分别室温孵育1 h，TBST液洗膜3遍，每遍10 min。最后用ChemiDoc高灵敏度化学发光成像仪显出蛋白条带。

1.2.4 ELISA

按照制造商的说明进行ELISA，检测细胞上清液中IL-1β的含量。

1.2.5 统计分析

本试验结果利用GraphPad Prism 9.0进行统计分析，试验得到的数据通过单因素方差分析（One-Way ANOVA）计算得到P值，统计学显著差异用*表示，其含义分别是*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.000 1。当*P＜0.05时，为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 HEK293T中验证质粒的表达

首先验证构建质粒的表达。将pro-IL-1β、pro-Caspase-1、ASC、NLRP3质粒以及空载体质粒转染至HEK293T细胞中，24 h后，收取细胞总蛋白，通过Western blot检测表达。结果显示，所有质粒均表达（图1）。

图1 Western blot验证HEK293T细胞中质粒的表达Fig. 1 The expression of plasmid in HEK293T cells was verified by Western blot

2.2 HEK293T中NLRP3炎性小体活性的检测

NLRP3炎性小体活化的标志之一是产生成熟的IL-1β。IL-1β的前体（pro-IL-1β，相对分子质量约为37 kD）可被Caspase-1切割形成成熟体（相对分质子量为17 kD），成熟体通过细胞孔道释放到细胞外，发挥生物活性［17］。因此，我们可利用Western blot 以及ELISA分别检测细胞蛋白和上清中的IL-1β成熟体。

通过Western blot发现，只转染pro-IL-1β或者只转染部分NLRP3炎性小体组分（转染ASC，或NLRP3和ASC共转染）的细胞总蛋白中检测不到IL-1β成熟体，只有转染了NLRP3炎性小体全部组分的细胞总蛋白可检测到IL-1β成熟体（图2）。同时，利用ELISA检测细胞上清中的IL-1β，得到的结果和Western blot检测一样（图3）。以上结果说明，在HEK293T中构建NLRP3炎性小体活化体系成功。

图2 Western blot检测重建NLRP3炎性小体组分的HEK293T细胞总蛋白中的IL-1β成熟体Fig. 2 Detection of mature IL-1β in cell lysates from HEK293T cells reconstituted with NLRP3 inflammasome components by Western blot

图3 ELISA检测重建NLRP3炎性小体组分的HEK293T细胞上清中的IL-1βFig. 3 Detection of IL-1β in supernatants of HEK293T cells reconstituted with NLRP3 in flammasome components

2.3 NLRP3转染量与NLRP3炎性小体活性正相关

为了进一步研究HEK293T中NLRP3炎性小体活化体系，我们固定ASC、Caspase-1以及pro-IL-1β的转染量，同时转染不同量的NLRP3（50、100、200 ng），发现随着NLRP3转染量的提高，无论是细胞中或者上清中IL-1β的成熟体都是逐渐增加的（图4、5），并呈一个正相关的趋势。以上结果说明，改变NLRP3质粒的转染量可调整HEK293T中炎性小体活化的强度。

图4 Western blot检测不同NLRP3转染量对HEK293T中重建炎性小体的影响Fig. 4 The effects of transfected NLRP3 amounts in reconstruction of inflammasome in HEK293T cells by Western blot

3 讨论

HEK293T细胞来源于人胚胎肾上皮细胞，是一个研究外源基因表达的常用细胞系［18-20］。HEK293T细胞中不表达NLRP3炎性小体组分，自2006年首次报道在该细胞系中构建炎性小体活化体系后［21］，其逐渐成为用于体外研究NLRP3炎性小体活化的常规工具细胞系［11-12］。本研究首先验证了质粒NLRP3、ASC、Caspase-1以及pro-1β的表达，接着将不同量的质粒共转染至HEK293T中构建NLRP3炎性小体活化体系，发现转染缺少完整炎性小体组分的HEK293T细胞中几乎检测不到IL-1β成熟体，而转染了NLRP3炎性小体所有组分后，则可检测到IL-1β成熟体，说明NLRP3、ASC和Caspases-1是体外构建NLRP3炎性小体活化体系必不可少的元件，这也与之前的文献报道相一致［11-12］。同时，我们在此基础上对该体系进行了进一步的探索，发现在不改变ASC、Caspase-1以及pro-IL-1β的转染量的情况下，增加NLRP3转染量可促进更多IL-1β成熟体的产生。该结果提示，改变NLRP3转染量可调控HEK293T细胞中炎性小体活化的强度，这也为不同实验室在各自研究体系下优化该系统提供了一定的参考。另外，我们还介绍了通过Western blot以及ELISA两种方法检测HEK293T中NLRP3炎性小体活化的情况，通过比对两种方法的检测效果可以发现，两者提供的检测效能较一致，因此，其他实验室也可选择任何一种方式来检测炎性小体的活化。在这里，我们更推荐使用ELISA方法检测，因为Western blot的操作流程复杂，完成一次操作的试验时间较ELISA检测更长，且ELISA的检测结果是以数字形式呈现的，用于结果定量更加方便。综上所述，我们提供了在HEK293T细胞中建立NLRP3炎性小体活化体系的方法，该方法的建立为后期进一步研究NLRP3炎性小体的调控机制奠定了基础。

图5 ELISA检测不同NLRP3转染量对HEK293T中重建炎性小体的影响Fig. 5 The effects of transfected NLRP3 amounts in reconstruction of inflammasome in HEK293T cells by ELISA