基于自由基控制的青稞脂肪酶射频灭活技术研究

李永富, 王雪真, 黄金荣, 史 锋, 陈正行

(江南大学食品学院；江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室1，无锡 214122) (江南大学食品科学与技术国家重点实验室2，无锡 214122)

青稞属禾本科一年生草本植物，又称米大麦、裸大麦、元麦等，作为青藏高原地区最主要的作物，青稞具有高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖的特点，符合现代 “三高两低” 的饮食结构需求[1]。青稞产后损失严重，陈化是造成其品质降低的主要原因，这与青稞本身的特点密切相关。一方面，青稞中含有高比例的多不饱和脂肪酸，导致其在储藏过程中容易发生氧化变质；另一方面，青稞中含有多种内源酶，包括脂肪酶、脂肪氧合酶、过氧化物酶等，在储藏过程中会导致脂质快速水解和氧化[2]。常见的青稞灭酶处理方式主要包括：蒸制、炒制、微波灭酶以及过热蒸汽灭酶等[3]。热处理可以灭活谷物中的脂肪酶，但同时也会产生大量以碳为中心的稳定型自由基，从而诱导非酶氧化，且自由基含量越高，氧化速率越快[4]。研究表明，烷基自由基的存在是导致薏仁米脂质氧化的重要因素[5]。因此，在保证一定灭酶率的前提下，控制热处理后青稞中的自由基强度并保持其在储藏期间的相对稳定状态对于减缓储藏期间青稞中脂质的氧化劣变具有重要意义。

射频(Radio Frequency, RF)是一种频率范围在3 KHz～300 MHz的高频交流电磁波，作为一种新型的介电加热方式，射频具有加热速度快、加热均匀、能量穿透深度大、含水率自平衡等优点[6]。射频技术在粮食中的应用包括干燥、杀菌、杀虫等，而射频用于粮食灭酶方面的研究较少，特别是针对谷物籽粒灭酶方法及其储藏稳定性的研究[7]。只有少数研究针对谷物加工副产品如米糠和小麦胚芽等中脂肪酶、脂肪氧合酶、过氧化物酶的灭活以及对马铃薯中多酚氧化酶的灭活[8-10]，灭酶效果显著且均显示出良好的储藏稳定性。关于射频技术对青稞脂肪酶的灭活效果及储藏稳定性影响的研究还鲜有报道。

本研究利用射频技术对青稞进行灭酶处理，考察极板间距、射频温度、保温时间和补水量对脂肪酶灭活效果的影响，探究青稞在灭酶后的储藏稳定性。然后，通过控制自由基强度使其储藏稳定性得到改善。本研究主要从脂肪酶活度、脂肪酸值、自由基信号强度、己醛含量等指标来表征青稞射频处理和储藏效果，以期为射频处理延长青稞货架期的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

昆仑15号黄青稞，含水量12.80%，产地青海，于2019年10月采收，三道脱皮。

试剂：无水乙醇、氢氧化钾、三油酸甘油酯、无水乙醚(分析纯)、己醛标准品(纯度99.9%)；实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

GJ-3-27-JY高频真空介质加热射频装置，BJ-300多功能粉碎机，SCIONSQ-456-GC气质联用仪，EMXplus-10/12电子自旋共振波谱仪，LXJ-IIB低速离心机，LRH-150恒温生化培养箱，HYL-A全温摇瓶柜。

1.3 方法

1.3.1 青稞脂肪酶的射频灭活处理

称取480 g青稞置于聚丙烯盒(14.0 cm×10.5 cm×4.5 cm)中，并放入自制泡沫盒(减少散热)，然后置于射频腔下极板中央，设置不同射频处理参数包括：极板间距、射频温度和保温时间对青稞进行灭酶处理。射频处理结束后将青稞取出，冷却后装入自封袋中，进行品质分析。

1.3.1.1 极板间距对青稞脂肪酶灭活率的影响

在射频温度125 ℃，保温时间0 min条件下，设置极板间距分别为110、120、130、140、150 mm，计算射频升温速率。

1.3.1.2 射频温度和保温时间对青稞脂肪酶灭活率的影响

在极板间距120 mm条件下，设置射频温度105、115、125、135 ℃，升温时间分别约为：14.6、17.7、19.6、23.4 min，对于每个温度，当射频系统达到设定温度后再分别保温0、20、60 min。

1.3.1.3 射频处理对不同补水量的青稞脂肪酶灭活率的影响

用微量喷壶对原料青稞进行补水处理，每次喷雾量约为1 mL，边加边搅拌，获得补水量为2%、3%、4%、5%和6%的青稞样品，分别混匀后装入自封袋于25 ℃平衡12 h。在极板间距120 mm，射频温度125 ℃条件下，对每个补水量下的青稞分别保温0、20、60 min。补水量按式(1)计算：

(1)

式中：m为样品质量/g；W1为目标含水量/%；W0为原始含水量/%。

1.3.1.4 基于自由基控制的射频处理青稞样品的制备

对原料青稞分别补水2%、3%、4%，在每个补水量下分别经射频95 ℃保温0 min、105 ℃保温0 min、115 ℃保温0 min处理，前期研究发现，延长射频保温时间会导致自由基大量增加，因此每个温度均采用保温0 min处理。另参照常见的粮食射频杀菌杀虫条件，设一组不补水射频75 ℃保温10 min射频处理青稞样品。射频处理结束后将青稞取出，冷却后装入自封袋中，测定自由基信号强度，具体见表1。然后，以自由基信号强度为指标，并结合处理后的含水量，在不超过初始含水量的基础上，选出每个射频温度下自由基信号强度最小的青稞样品，即RF 75 ℃/10 min/0%(代表射频温度75 ℃、保温时间10 min、补水量0%，下同)、RF 95 ℃/0 min/2%、RF 105 ℃/0 min/3%、RF 115 ℃/0 min/0%，进行加速储藏实验。

表1 不同补水量青稞经射频处理后的自由基强度和含水量

1.3.2 储藏实验设计

1.3.2.1 最高脂肪酶灭活率的射频处理青稞的储藏

将RF 125 ℃/0 min，4%条件下处理后的青稞样品混匀后用自封袋包装，置于37 ℃恒温生化培养箱中储藏30 d，每隔6 d取样，待其恒温至室温后放入-18 ℃冰箱中冷冻备用。未处理青稞在相同条件下储藏30 d作对照实验。对2组样品进行储藏指标检测分析。

1.3.2.2 基于自由基控制的射频处理青稞的储藏

将RF 75 ℃/10 min/0%、RF 95 ℃/0 min/2%、RF 105 ℃/0 min/3%和RF 115 ℃/0 min/0%条件下处理后的4组青稞样品分别混匀后用自封袋包装，储藏及取样方式同1.3.2.1。

1.3.3 储藏实验指标的测定

1.3.3.1 含水量的测定

含水量的测定参照GB 5009.3—2016中的直接干燥法进行测定。

1.3.3.2 脂肪酶活度的测定

脂肪酶活度的测定方法参照GB/T 5523—2008并做适当修改。将青稞粉碎过60目，于100 mL具塞锥形瓶中加入pH 7.4的磷酸缓冲液20 mL，并称取约2 g青稞粉，滴加1.0 g三油酸甘油酯，玻璃棒轻轻搅匀。加塞后，置于30 ℃摇床中保温24 h，转速为120 r/min。取出后加入50 mL乙醇乙醚混合液振荡，静置1～2 min，加盖过滤至50 mL离心管中，取25 mL滤液于锥形瓶中，加3～5滴酚酞指示剂后，用0.005mol/L的氢氧化钾溶液滴定，滴定至微红色且30 s不褪色即为滴定终点。做空白实验，除不用30 ℃保温24 h外，其余操作同上。脂肪酶活度以中和1 g干基样品中生成游离脂肪酸所消耗的氢氧化钾的毫克数表示。灭酶率按式(2)计算：

(2)

式中：A1为未处理青稞脂肪酶活度/mg/g；A2为射频处理青稞脂肪酶活度/mg/g。

1.3.3.3 脂肪酸值的测定

脂肪酸值的测定方法参照GB/T 5684—2015并做适当修改。称取5.00 g青稞粉于50 mL离心管中，加入30 mL 95%乙醇，室温下(25±5)℃置于磁力搅拌器上搅拌1 h，2 500 r/min离心分离5 min，取上清液20 mL于锥形瓶中，加3～5滴酚酞指示剂，用 0.005 mol/L KOH-乙醇滴定液滴定至微红色并保持30 s不褪色即为滴定终点。脂肪酸值以中和100 g青稞粉(干基)中游离脂肪酸所需KOH毫克数表示。

1.3.3.4 己醛含量的测定

己醛含量采用顶空气相色谱法进行测定，通过己醛标准品确定其保留时间及含量。具体操作为：以癸烷标准品作为内标，称取约1 g青稞粉样品加入气相瓶中，加入5 mL去离子水和1 mL质量浓度为20 μg/mL的正葵烷内标液，振荡至固液完全互溶，标样中加入1 mL质量浓度为20 μg/mL的正葵烷内标液和2.5 mL质量浓度为2 μg/mL的己醛标液，振荡10 s混匀，待测。顶空气相测定条件参照Mexis等[11]的方法。

1.3.3.5 自由基信号强度的测定

将青稞粉碎过80目筛，称取青稞粉(60.0±0.5) mg于直径为9 mm的核磁管中，使青稞粉在核磁管底部均匀分布。使用电子自旋共振波谱仪(ESR)进行青稞粉自由基信号强度的测定。测定条件如下：中心磁场3 360 G，扫场宽度100 G，扫描时间60 s，微波功率20 mW，g=2.000 0，图谱在室温20 ℃下测定。自由基信号强度以最高峰处的峰高与1 g样品(干基)质量的比值来表示。

1.4 数据处理

所有实验均独立重复进行3次操作。采用Origin 9.0绘图。实验数据采用Excel 2007进行统计分析，结果以平均值±标准偏差的形式表示。用SPSS Statistics 22进行ANOVA方差分析，选择Duncan检验和t检验进行显著性分析，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 射频灭活青稞脂肪酶的参数优化

2.1.1 极板间距对青稞脂肪酶灭活率的影响

由图1可知，随着极板间距的增大，射频的升温速率逐渐减小，且减小的趋势逐渐变缓。在极板间距为120 mm时，脂肪酶的活度最低，灭酶率达到62.52%。增大或减小极板间距脂肪酶活度均有所升高。当极板间距较大时，样品吸收的功率减少，从而转化为热能用于灭酶的能量减少；当极板间距较小时同样不利于灭酶，这是因为极板间距越小，射频中加热电路的频率与发生电路的固有频率耦合程度越大，样品吸收的功率越大，升温速率随之增大[12]；但过高的升温速率会导致加热均匀性下降，灭酶效果变差。因此，射频极板间距选择120 mm的极板间距用于后续实验，此时升温速率为5.05 ℃/min，这与其他学者用于射频处理豆类的最适升温速率(5～6 ℃/min)相近[13]。

注：相同指标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。图1 极板间距对脂肪酶活度和升温速率的影响

2.1.2 射频温度和保温时间对青稞脂肪酶灭活率的影响

由图2可知，3种射频温度下均能够显著降低脂肪酶活度(P<0.05)，且当温度为125 ℃时脂肪酶活度最低，这说明较高的射频温度可有效灭活青稞脂肪酶。在125 ℃保温20 min时脂肪酶活度最低，此时灭酶率达68%，继续延长保温时间对灭酶效果的影响不显著。当射频温度为105 ℃和115 ℃时，保温20 min时脂肪酶活度略有升高，这可能是射频导致的脂肪酶“复活”，一方面可能因为射频形成的电场影响了脂肪酶内部的电荷分布，导致脂肪酶α-螺旋盖状结构打开，将活性中心暴露出来，从而底物能够更靠近活性中心[14]；另一方面，由于射频处理后水分减少，介电常数下降，当脂肪酶在水-脂界面上被吸附时，由于两种介质的介电性质发生变化，导致脂肪酶“盖子”的构象发生重排(即氨基酸残基之间的氢键重排)，活性中心暴露[15]。实验中发现135 ℃下保温0 min时，青稞发生明显焦化现象，故未对其做进一步分析。综合考虑射频处理青稞的效果，射频温度宜为125 ℃。

注：同一保温时间不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著，同一处理组的不同大写字母表示在P<0.05水平上差异显著，余同。图2 射频温度和保温时间对脂肪酶活度的影响

2.1.3 射频处理对不同补水量的青稞脂肪酶活度的影响

由图3可见，补水量过高或过低都不利于射频灭酶，最佳补水量为4%，在此补水量下射频125 ℃保温20 min比保温0 min的脂肪酶活度略低但无显著性差异，考虑到节约时间和成本，最终选择补水4%，125 ℃保温0 min进行射频灭酶处理，最大灭酶率可达75.58%。这说明，对青稞进行适当补水可提高灭酶率。在其他加热灭酶方式中也有类似的发现，如适当的补水可提高过热蒸汽对燕麦[16]以及微波对米糠[17]的灭酶效果。当补充的水分过多时，射频能量主要被用于青稞表面水分的散失，用于青稞灭酶的能量减少；此外，根据实验经验，补水量越高，射频升温速率越高，过高的升温速率会导致均匀性变差，同样不利于灭酶。补充少量水分时，青稞水分活度增大，这有利于提高脂肪酶在低介电介质环境中的柔韧性，导致酶活性增强[18]。

图3 射频处理对不同补水量的青稞脂肪酶活度的影响

2.2 射频处理对青稞储藏稳定性的影响

2.2.1 最大脂肪酶灭活率的射频处理青稞储藏稳定性分析

2.2.1.1 储藏期间青稞脂肪酶活度的变化

青稞中脂肪酶主要来源于皮层中的内源性脂肪酶以及微生物产生的外源脂肪酶[19]。图4表明，射频处理后青稞脂肪酶活度显著降低，一方面是高温使蛋白质变性，脂肪酶失活；另一方面，可能由于加热处理后，青稞表面的微生物数量减少，因此外源性脂肪酶含量减少。储藏期间，未处理组青稞的脂肪酶活度处于上下波动的变化状态，这可能与脂肪酸的变化有关，储藏期间游离脂肪酸的累积导致青稞pH不断降低，当超过脂肪酶的最适pH会使其活性受到抑制，脂肪酸进一步氧化会使pH升高，当达到其最适pH时脂肪酶活度又会因此升高[20]。这与胡敏[21]认为脂肪酶活力随着储藏时间的延长呈现上升趋势的结论不一致。射频组青稞的脂肪酶活度在储藏期间呈缓慢上升趋势，储藏30 d后相对0 d增加了125.74%，相对应的未处理组则增加了12.70%。由于射频无法将青稞脂肪酶完全灭活，储藏后期可能出现了脂肪酶“复活”现象。类似地，Srivastava 等[22]发现对小麦胚芽经过热处理后脂肪酶被完全灭活，但储藏过程中游离脂肪酸仍不断增长。因此，射频处理可有效灭活脂肪酶，且在30 d的储藏期间能使脂肪酶活度维持在相对较低的水平。

注：同一处理组不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，反之，差异不显著(P>0.05)；同一储藏时间不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，反之，差异不显著(P>0.05)，下同。图4 储藏期间青稞脂肪酶活度的变化

2.2.1.2 储藏期间青稞脂肪酸值的变化

如图5所示，射频处理后青稞的脂肪酸值显著低于未处理组(P<0.05)，可能是因为射频处理促进了游离脂肪酸的氧化，使其进一步分解成小分子醛类物质，由图6可见，射频处理后的青稞己醛含量显著高于未处理组(P<0.05)，也有可能是脂肪酸与其他物质相结合所致。储藏期间，射频组青稞其脂肪酸值显著低于同时期的未处理组(P<0.05)，这主要是由于射频的热效应导致脂肪酶活度明显降低，减少了对青稞脂质的水解。脂肪酸累积会对储藏稳定性产生不利影响，游离脂肪酸中的极性基团能够催化脂质氢过氧化物分解产生自由基，促进链式反应，加速脂质氧化[23]。因此，经射频处理可明显降低青稞脂肪酸值，且能较好地控制其在储藏期间的快速增长，有利于提高其储藏稳定性。

图5 储藏期间青稞脂肪酸值的变化

2.2.1.3 储藏期间青稞己醛含量的变化

己醛是脂肪氧化进程中的终产物之一，被认为是粮食陈化产生“陈米臭”的主要来源。由图6可知，储藏期间2组样品己醛含量均呈上升趋势，且射频组己醛含量显著高于未处理组(P<0.05)。储藏30 d时射频处理前、后的青稞己醛含量与0 d相比分别升高了134.46%、91.52%，未处理组己醛的升幅更高。射频作为一种介电加热处理方式，高温会加速脂质的氧化降解产生小分子物质，导致己醛含量升高，且有学者指出加热的前处理方式是导致燕麦中己醛出现并不断升高的原因之一[24]；另一方面，射频处理后自由基含量增多，尤其是以碳为中心的自由基如烷基自由基等，会促进链式反应，加速脂质氧化，导致小分子醛类物质的增加[25]。实验中发现，储藏到6 d时，未处理青稞己醛含量为1.329 μg/g，可闻到轻微哈败味，储藏至18 d时，未处理青稞己醛含量为2.280 μg/g，可闻到严重哈败味；对于射频处理后的青稞，在30 d的储藏过程中均未闻到明显的哈败味，可能是射频高温处理过程中青稞表面发生美拉德反应，增加了青稞的风味，哈败味被掩盖。

图6 储藏期间青稞己醛含量的变化

2.2.1.4 储藏期间青稞自由基强度的变化

图7反映了射频处理前后青稞中自由基信号强度的变化，这是典型的碳自由基的信号峰，经射频处理后，该信号峰强度显著增加，与未处理青稞相比增长了58.19%。大米淀粉和蛋白质在微波处理后发生热解，产生以碳为中心的自由基，从而导致醛类和呋喃等小分子物质的形成[26,27]；张岭[28]发现高温流化技术处理后的糙米中产生了大量稳定型的碳自由基，并推测这是加速高温流化糙米脂质氧化速率的原因之一。此外，射频加热过程中电磁场不断变换，极性的油脂分子发生转动，可能改变脂肪酸的碳链结构，降低了自由基反应所需的键能，从而加快自由基链式反应，产生大量自由基。因此，可推断射频的高温处理过程可能使青稞中蛋白质、淀粉和脂质等大分子物质裂解，导致自由基强度增加。由图8可知，储藏期间2组青稞样品的自由基强度均呈先增加后减小再增加的波动变化状态，在自动氧化的链式反应过程中，不断伴随着自由基的生成和消解，自由基数量出现波动。对于同一储藏时期的2组青稞样品，射频处理后的青稞自由基信号强度均显著高于未处理组(P<0.05)，储藏至30 d时，与 0 d相比射频处理前、后的青稞自由基强度分别增加了48.77%、23.98%；这与林露芬等[29]对黄糠经微波处理后自由基在储藏期间的变化情况类似，即随储藏时间延长自由基信号强度也不断增强，且推测这一现象与脂肪的持续氧化有关。因此，控制射频处理后的青稞自由基强度对于提高青稞储藏稳定性具有重要意义。

图7 射频处理前后青稞自由基信号强度的ESR光谱图

图8 储藏期间青稞自由基强度的变化

2.2.2 基于自由基控制的射频处理青稞储藏性分析

2.2.2.1 射频处理青稞储藏期间自由基信号强度的变化

由图9可知，储藏期间，4组射频处理后的青稞自由基信号强度均呈缓慢上升趋势。信号强度由大到小排序为：RF 115 ℃/0 min>RF 75 ℃/10 min>RF 105 ℃/0 min/3%≈RF 95 ℃/0 min/2%。补水量增大有助于提高射频传热效率从而促进自由基的生长，另一方面，水分对自由基也有一定的淬灭作用，在这两种因素共同作用下，RF 105 ℃/0 min/3%和RF 95 ℃/0 min/2%这2组样品在同一储藏时间的自由基信号强度无显著性差异(P<0.05)。储藏30 d时，RF 75 ℃/10 min、RF 95 ℃/0 min/2%、RF 105 ℃/0 min/3%和RF 115 ℃/0 min样品的自由基信号强度分别升高了52.16%、68.14%、98.49%、109.68%。可以看出，射频温度越高，自由基信号强度的增长幅度越大，加速了青稞的氧化速率。

图9 不同射频处理样品储藏30 d自由基信号强度的变化

2.2.2.2 射频处理青稞储藏期间脂肪酶活度的变化

由图10可知，储藏期间对于同一处理条件下的青稞，其脂肪酶活度均呈上下波动的变化状态，这可能与脂肪酸的变化有关[20]。RF 95 ℃/0 min/2%、RF 105 ℃/0 min/3%和RF 115 ℃/0 min这3组样品的脂肪酶活度及其变化幅度显著低于RF 75℃/10 min组样品(P<0.05)，这说明射频温度较低时不足以灭活青稞脂肪酶。储藏30 d时，RF 75 ℃/10 min组青稞脂肪酶活度升高了24.40%，射频处理后青稞脂肪酶出现了“复活”，其他几组青稞也可见同样现象，但程度不一。

图10 不同射频处理样品储藏30 d脂肪酶活度的变化

2.2.2.3 射频处理青稞储藏期间己醛含量的变化

图11反映了不同射频处理条件下的青稞样品在储藏期间己醛含量的变化。储藏期间，4组射频处理后的青稞己醛含量均呈上升趋势。储藏30 d时，RF 75 ℃/10 min、RF 95 ℃/0 min/2%、RF 105 ℃/0 min/3%和RF 115 ℃/0 min己醛含量分别升高了72.25%、65.98%、171.02%、182.74%。由此可见，射频温度越高，己醛含量增长速率越快，说明加速氧化的程度更重，而与此相对应的自由基信号强度的增长幅度也越大。比较可知，RF 95 ℃/0 min/2%处理后的青稞在储藏30 d后己醛含量为4组样品中最低，脂肪酶活度无显著升高，自由基信号强度与0 d时无显著性差异，氧化程度最轻。

图11 不同射频处理样品储藏30 d己醛含量的变化

3 结论

射频加热灭活青稞脂肪酶的过程中，射频温度是提高灭酶率的关键因素，温度越高射频灭酶效果越好，在115～125 ℃温度范围内脂肪酶活度显著下降，但自由基信号强度也随之增加，这会加速青稞的氧化。对青稞适度补水并充分平衡后进行射频处理，可提高射频灭酶率，同时对自由基也有一定的淬灭作用。RF 125 ℃/0 min/4%处理后青稞的脂肪氧化速率增加，分析发现射频高温处理过程中导致的自由基强度显著增加是加速氧化的主要原因。基于自由基控制射频处理青稞储藏稳定性得到提高，其中RF 95 ℃/0 min,2%处理后的青稞氧化程度最轻。因此，为提高青稞储藏稳定性，需要对青稞中的脂肪酶适度灭活，控制自由基强度也是加工时首要考虑因素。