基于PI3K/AKT 信号通路探讨表儿茶素对口腔癌细胞的作用

谢明杰，陈穗保

（广东省第二人民医院口腔科，广东 广州 510317）

口腔癌（oral cancer）是一种世界范围内的高发病率癌症，死亡率较高[1-3]。随着咀嚼槟榔、饮酒和吸烟的人群逐渐增多，口腔癌在多个国家的发病率和死亡率逐年增加[4，5]。因此，通过开发更有效的治疗方法来治愈口腔癌至关重要。抗癌药物与放疗联合是治疗口腔癌的常见策略[6，7]。然而，这种联合治疗通常会对正常组织产生严重的副作用，患者依从性和预后较差。表儿茶素（Epicatechin）作为茶多酚中主要的活性单体，药理作用广泛，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、预防心血管疾病、改善糖尿病和免疫调节等作用[8-10]。研究表明[11]，PI3K/AKT 信号通路对口腔癌细胞增殖、侵袭、抑制凋亡和血管生成均起着重要作用。本研究旨在通过PI3K/AKT 信号通路探讨表儿茶素对口腔癌细胞的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 药物与试剂 表儿茶素，纯度＞98%，批号：SE8100，购于上海脉铂医药科技有限公司；TNF-α和IL-1β ELISA 试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司；人口腔癌KB 细胞购于中科院上海细胞库；CCK-8 购于上海碧云天生物技术公司；RPMI-1640 细胞培养液、胎牛血清（FBS）购于美国gibco公司；PI3K 和AKT 单抗和GAPDH 二抗购于英国Abcam 公司。

1.2 主要仪器 DYCZ-24DN 迷你双垂直电泳仪电泳槽蛋白凝胶电泳仪、WD-9413A 凝胶成像分析系统和WD-9402D 型梯度PCR 仪购于北京六一仪器厂；二氧化碳培养箱购于Thermo Fisher Scientific 公司；SKSW-KC-100 型酶标仪购于北京海富达科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 37 ℃孵育复苏人口腔癌KB 细胞后，使用1%双抗RMPI-1640 培养液（含10%FBS），于5% CO2和37 ℃细胞培养箱中常规传代培养细胞。

1.3.2 细胞增殖抑制率（CCK-8 法）选择对数生长期的人口腔癌KB 细胞，采用0.25%胰酶-EDTA 消化贴壁细胞，新鲜完全培养基终止反应、1000 rpm离心5 min，稀释为1×104个细胞，100 μl/孔接种于96 孔板，细胞培养箱静置培养24 h，分别加入浓度为20、40、80、160 nmol/L 的表儿茶素处理，0 nmol/L 为空白对照组，每组设定6 个复孔。放回细胞培养箱分别再培养24、48、72 h 后，每孔加入10 μl的CCK8 试剂并放回细胞培养箱中孵育3 h，在450 nm 波长处检测各孔OD 值，分析各组细胞的增殖抑制率。其中，增殖抑制率（%）=[1－OD（λ）药物处理组/OD（λ）空白对照组]×100%

1.3.3 细胞TNF-α 和IL-1β 水平（ELISA 法）取对数生长期的人口腔癌KB 细胞，稀释成1×105个后，1 ml/孔接种于24 孔培养板中，继续在细胞培养箱中培养24 h，分别加入表儿茶素处理，其终浓度分别为20、40、80、160 nmol/L，0 nmol/L 为空白对照组，每组设定6 个重复孔，继续培养细胞48 h，收集细胞上清，按试剂盒说明书操作步骤，检测细胞上清TNF-α 和IL-1β 水平。

1.3.4 细胞Bax 和Bcl-2 基因表达水平（RT-PCR法）按1.3.3 方法处理细胞后，PBS 缓冲液冲洗细胞3 次，提取细胞总RNA，使用PCR 仪检测Bax 和Bcl-2 基因的表达水平。Bax 和Bcl-2 的引物序列见表1。

表1 Bax 和Bcl-2 的引物序列

1.3.5 细胞PI3K 和AKT 蛋白表达水平（Western blot法）按1.3.3 方法处理细胞后，裂解细胞和检测细胞蛋白。配制电泳凝胶（12%分离胶和5%浓缩胶），每孔30 μg/孔上样，SDS-PAGE 电泳分离（120 V）、转膜（80 V）、5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入PI3K（1∶1000）和AKT（1∶1000）一抗4 ℃冰箱孵育过夜。洗膜5 次后，加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，洗膜5 次，专用仪器自动曝光。分析图像的灰度值（Image J 软件）。目的蛋白表达水平=目的条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件分析实验数据，计量资料以（）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t法，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组增殖抑制率比较 表儿茶素处理组24、48、72 h 增殖抑制率高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且80 nmol/L 表儿茶素组和160 nmol/L表儿茶素组24、48、72 h 增殖抑制率均高于20 nmol/L表儿茶素组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 表儿茶素对人口腔癌KB 细胞的增殖抑制率的影响

2.2 各组TNF-α 和IL-1β 水平比较 表儿茶素处理组TNF-α 和IL-1β 水平低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且80 nmol/L 表儿茶素组和160 nmol/L 表儿茶素组TNF-α 和IL-1β 水平低于20 nmol/L 表儿茶素组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 表儿茶素对人口腔癌KB 细胞TNF-α 和IL-1β 水平的影响

2.3 各组Bcl-2 和Bax mRNA 表达比较 表儿茶素处理组Bcl-2 mRNA 表达量低于空白对照组，而Bax mRNA 表达量高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且80 nmol/L 表儿茶素组和160 nmol/L 表儿茶素组Bcl-2 mRNA 表达量低于20 nmol/L 表儿茶素组，而Bax mRNA 表达量高于20 nmol/L 表儿茶素组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 表儿茶素对人口腔癌KB 细胞Bcl-2 和Bax mRNA 表达的影响

2.4 各组PI3K 和AKT 蛋白表达比较 表儿茶素处理组PI3K 和AKT 蛋白表达水平低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且80 nmol/L 表儿茶素组和160 nmol/L 表儿茶素组PI3K 和AKT 蛋白表达水平低于20 nmol/L 表儿茶素组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 表儿茶素对人口腔癌KB 细胞PI3K 和AKT 蛋白表达的影响

3 讨论

口腔癌是世界上最常见癌症之一，其5 年生存率较低，不超过50%[12]。口腔癌的治疗包括手术、放疗、化疗和靶向治疗等。最常用的化疗药物有5-氟尿嘧啶、卡铂、顺铂和紫杉醇[13]。然而，耐药性和副作用大仍然是化疗的重要障碍。因此，开发更有效以及更安全的抗口腔癌药物极为重要。

肿瘤细胞一般呈现出增殖和分化异常的基本特征，如控制肿瘤细胞增殖和分化可作为初步判断药物有效性的依据之一[14]。本研究结果显示，表儿茶素处理组24、48、72 h 增殖抑制率高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且80 nmol/L 表儿茶素组和160 nmol/L 表儿茶素组24、48、72 h 增殖抑制率均高于20 nmol/L 表儿茶素组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示表儿茶素可明显抑制人口腔癌KB细胞的增殖，呈浓度和时间依赖性。多种炎症因子与癌症的发生发展密切相关。有研究显示[15，16]，高水平的TNF-α 可明显促进肿瘤恶化，而IL-1β 参与了肿瘤的发生与转移。本研究结果显示，表儿茶素处理组TNF-α 和IL-1β 水平低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且80 nmol/L 表儿茶素组和160 nmol/L 表儿茶素组TNF-α 和IL-1β 水平低于20 nmol/L 表儿茶素组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明表儿茶素可降低人口腔癌KB 细胞TNF-α 和IL-1β 的水平，提示表儿茶素可能通过抑制炎症，进而抑制口腔癌细胞的过度增殖。此外，促进异常细胞的凋亡也是抗癌的重要策略，而线粒体凋亡途径是细胞重要的凋亡途径，Bcl-2 和Bax 是线粒体凋亡途径中重要的调控因子[17]。本研究结果表明，表儿茶素处理组Bcl-2 mRNA 表达量低于空白对照组，而Bax mRNA 表达量高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且80 nmol/L 表儿茶素组和160 nmol/L 表儿茶素组Bcl-2 mRNA 表达量低于20 nmol/L 表儿茶素组，而Bax mRNA 表达量高于20 nmol/L 表儿茶素组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明表儿茶素上调人口腔癌KB 细胞Bax mRNA 的表达水平，而下调Bcl-2 mRNA 的表达水平，呈浓度依赖性，提示表儿茶素可能通过影响线粒体凋亡途径，促进人口腔癌KB 细胞的凋亡。研究显示[18-20]，PI3K/AKT 信号通路参与调控癌细胞的增殖、分化和侵袭等。本研究结果表明，表儿茶素处理组PI3K 和AKT 蛋白表达水平低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且80 nmol/L 表儿茶素组和160 nmol/L 表儿茶素组PI3K 和AKT 蛋白表达水平低于20 nmol/L 表儿茶素组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示表儿茶素通过抑制PI3K/AKT 信号通路PI3K 和AKT 蛋白的表达水平，从而抑制人口腔癌KB 细胞的过度增殖。

综上所述，表儿茶素可抑制人口腔癌KB 细胞的过度增殖，促进其凋亡，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT 信号通路有关。