基于反相高效液相色谱技术测定市售羊乳粉中蛋白

宋卓岩，乔春艳，张雪茹，郝 果，刘永峰,*

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062；2.富平县检验检测中心，陕西 富平 711700）

羊乳作为一种天然产物，含有丰富的高生物价蛋白质、必需脂肪酸、维生素和矿物质等200多种营养和生物活性物质[1]，其所含的钙质能有效预防骨质疏松症，促进骨骼发育。此外，羊乳的脂肪颗粒体积比牛乳更小，更利于人体吸收，并且长期饮用羊乳也不会引起肥胖[2]。研究证实，婴儿对羊乳的消化率可达94%以上，具有较高的生物利用度，因此羊乳也被视为人乳最好的替代品[3]，是儿童、成人和老人的理想食物[4-5]。乳蛋白含量及组成作为羊乳粉的特征性成分可以反映乳粉制品真实的质量信息，酪蛋白作为乳蛋白的主要组成，其含量可有效反映乳品营养价值的高低[6]。

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）又称高压液相色谱，其原理是基于混合物中各组分在两相中的分配系数差异达到分离各物质的目的，通过紫外检测器或示差检测器对物质的响应得到对应吸收峰，从而实现对物质定性、定量检测的目的。该技术已经作为一项常规检测技术用于各行各业的检测需求，它具有分析速度快、分离效率高、操作自动化等优点。HPLC技术已经广泛应用于乳及乳制品中多种质量控制指标的检测，如乳的营养成分及含量分析、乳的风味物质种类及含量分析等[7]。Ochirkhuyag[8]利用HPLC对马乳αs-酪蛋白（αs-casein，αs-CN）的不同基因型进行了分离纯化。杨璐桐等[9]通过HPLC准确测定了人乳和牛乳中总核苷酸含量和组成，该方法具有较好的灵敏度、准确性和精密度，能满足日常对人乳或牛乳中总核苷酸定量测定的要求。Kaminarides等[10]采用HPLC分离奶牛乳、绵羊乳和山羊乳的酪蛋白成分，发现3 种酪蛋白组分均得到了很好的分离，山羊乳和绵羊乳的色谱图相似，但它们与牛乳的色谱图有很大不同。Veloso等[11]优化了HPLC-紫外检测分离定量牛乳κ-CN、α-CN和β-CN的方法，同样地，HPLC也可用于分离山羊乳清蛋白。

反相HPLC（reversed-phase HPLC，RP-HPLC）技术是利用不同蛋白质氨基酸侧链与RP-HPLC介质的疏水表面发生的可逆疏水作用的差异来实现对蛋白质的分离[12-13]。与其他色谱分析法相比，RP-HPLC具有更高的乳蛋白分离能力，可实现高速和自动化的乳制品品质测定[14]。Mora-Gutierrez等[15]利用等电点沉降法分别提取法国高山山羊和英国努比亚山羊乳中的酪蛋白，通过RP-HPLC技术从酪蛋白中分离出4 种成分，发现利用色谱分辨山羊乳中的αs1-CN含量差异明显。

近年来，羊乳粉在国内开始迅速发展，我国的羊乳粉品牌逐渐增多，确保市售羊乳粉质量是保证其持续高速发展的重要条件，但是目前对市售羊乳粉品质的系统研究比较少见。由于产地、季节、饲料、环境等因素的影响，羊乳的产量、质量、风味等均存在差异[16-18]，且羊乳经过杀菌、浓缩、干燥等处理后，羊乳粉组成也会产生变化[19-20]。准确测定羊乳粉中主要营养指标是评价羊乳粉品质的关键，本研究采用RP-HPLC技术，通过对不同地区市售羊乳粉中酪蛋白及乳清蛋白的种类、含量进行对比分析，评价不同地区市售羊乳粉的品质，以期为市售羊乳粉的品质评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

羊乳粉，市售，共35 种，产品种类包括纯羊乳粉与配方羊乳粉，同时对其中纯羊乳粉按产地分为陕西地区纯羊乳粉及非陕西地区纯羊乳粉，具体分类见表1。

BisTris、柠檬酸钠、盐酸胍、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）（分析纯） 天津市天力化学试剂有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、乙腈（色谱纯） 天津市福晨化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

U-3000 HPLC仪 美国热电公司；TGL-16aR高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 羊乳粉乳蛋白预处理

参考雷颖颖[13]的方法进行蛋白样品预处理。准确称取60 mg羊乳粉，用去离子水溶解并定容至2 mL；取400 μL羊乳粉溶液加入等体积工作液A（含0.1 mol/L BisTris、5.37 mmol/L柠檬酸钠、6 mol/L盐酸胍、19.5 mmol/L DTT），混匀静置1 h后于4 ℃、16 000 r/min离心5 min，除去上层脂肪；取300 μL下层溶液加入3 倍体积的工作液B（含4.5 mol/L盐酸胍的0.1% TFA水溶液）混匀，用0.22 μm滤膜过滤，待上机测定。

1.3.2 RP-HPLC测定羊乳粉乳蛋白

参考雷颖颖[13]的方法并略作修改，使用C18色谱柱，进样量20 μL，流速0.7 mL/min，在214 nm波长处采集信号，柱温保持在45 ℃洗脱32 min。流动相A为0.1% TFA水溶液，流动相B为0.1% TFA-乙腈溶液，经过抽滤、超声脱气后上机使用。梯度洗脱程序：33%～40%流动相B 9 min，40%～50%流动相B 15 min，50%～60%流动相B 2 min，60%流动相B 3 min，60%～33%流动相B 3 min。

根据出峰的顺序，通过峰面积对乳蛋白进行定性及相对定量分析。

1.4 数据处理

所有样品5 个平行，将RP-HPLC分析得到的数据进行统计，由仪器自带软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 羊乳粉乳蛋白的RP-HPLC测定结果

羊乳蛋白主要组成包括酪蛋白和乳清蛋白，其占比分别为75%和25%[21-22]。由图1可知，峰1保留时间约为13.7 min，为κ-CN，峰2保留时间约为14.0 min，为αs2-CN，峰3保留时间15.6～16.4 min，为αs1-CN，峰4保留时间16.3～16.4 min，为β-CN，峰5保留时间16.7～19.0 min，为乳清蛋白。

图1 羊乳粉乳蛋白的RP-HPLC图Fig. 1 RP-HPLC profile of goat milk powder proteins

2.2 羊乳粉乳蛋白组成

由表2可知，所有羊乳粉的乳蛋白组成中含量最多的是β-CN，含量最少的是αs1-CN。配方羊乳粉乳清蛋白相对含量高出纯羊乳粉50%左右，κ-CN相对含量高于纯羊乳粉30%左右，αs2-CN相对含量低于纯羊乳粉20%左右，β-CN相对含量低于纯羊乳粉24%左右，二者αs1-CN相对含量差异不大。经分析可得，不同区域的纯羊乳粉各组分含量区别不大，κ-CN、αs2-CN、αs1-CN、β-CN组成相似。

表2 羊乳粉乳蛋白组成测定结果Table 2 Protein composition of goat milk powder %

2.3 纯羊乳粉和配方羊乳粉乳蛋白组成与分析

为了解配方羊乳粉和纯羊乳粉的差异情况，选择4 个配方羊乳粉与4 个纯羊乳粉进行研究。由图2可知，纯羊乳粉乳蛋白中κ-CN相对含量12.70%～14.53%，αs2-CN相对含量12.90%～13.12%，αs1-CN相对含量7.21%～15.15%，β-CN相对含量38.57%～47.51%，乳清蛋白相对含量17.46%～21.23%。配方羊乳粉蛋白中κ-CN相对含量14.44%～21.45%，αs2-CN相对含量9.26%～11.96%，αs1-CN相对含量9.40%～12.33%，β-CN相对含量25.16%～41.35%，乳清蛋白相对含量20.53%～34.72%。对比纯羊乳粉和配方羊乳粉各蛋白组分相对含量发现，配方羊乳粉和纯羊乳粉各蛋白组分组成相似但相对含量有明显差异。

图2 纯羊乳粉与配方羊乳粉中各乳蛋白相对含量Fig. 2 Relative content of each protein in pure and formulated goat milk powder

2.4 不同地区纯羊乳粉乳蛋白组成与分析

为了有针对性地了解不同地区纯羊乳粉的差异情况，本研究选择6 个陕西地区纯羊乳粉与4 个非陕西地区纯羊乳粉进行研究。由图3可知，陕西地区纯羊乳粉乳蛋白中κ-CN相对含量12.70%～16.74%，αs2-CN相对含量12.81%～14.54%，αs1-CN相对含量7.21%～15.15%，β-CN相对含量38.57%～47.51%，乳清蛋白相对含量15.89%～21.23%。非陕西地区纯羊乳粉乳蛋白中κ-CN相对含量14.84%～16.98%，αs2-CN相对含量10.40%～13.67%，αs1-CN相对含量9.13%～13.74%，β-CN相对含量37.75%～49.25%，乳清蛋白相对含量6.72%～23.31%。对比陕西地区和非陕西地区纯羊乳粉各蛋白组分相对含量发现，各组分相对含量差异均不明显，表明不同地区纯羊乳粉蛋白组成及含量均相似。

图3 不同地区纯羊乳粉乳蛋白中各乳蛋白相对含量Fig. 3 Relative content of each protein in pure goat milk powder from different regions

3 讨 论

本研究中配方羊乳粉αs2-CN和β-CN相对含量分别低于纯羊乳粉20%和24%，κ-CN和乳清蛋白相对含量分别高于纯羊乳粉30%和50%，二者的αs1-CN相对含量基本一致。配方羊乳粉主要针对婴幼儿、老年人及特殊人群需要调配，由于不同人群在蛋白需求上的差异，所以与纯羊乳粉蛋白组成（除αs1-CN）差异显著。而酪蛋白含量与编码酪蛋白的基因紧密相关，如高频率基因CSN3BIEF能提高乳中酪蛋白的相对含量。酪蛋白基因多态性对αs1-CN和αs2-CN含量有一定影响，对αS1-CN的影响尤为明显。不同基因型对αs1-CN含量影响也不同，如强等位基因对应αs1-CN含量为3.6 g/L，中度等位基因对应αs1-CN含量为1.6 g/L，弱等位基因对应αs1-CN含量为0.6 g/L，而无效等位基因对应αs1-CN含量极少甚至没有[23-25]。由此说明，配方羊乳粉和纯羊乳粉的蛋白含量有差异与编码酪蛋白的基因不同紧密相关。

αs1-CN和β-乳球蛋白是乳源中主要的致敏性蛋白，二者含量较高时，不适于患有“过敏症”的人群食用。山羊乳中的αs1-CN含量比牛乳中低38.57%，山羊乳中的κ-CN和β-CN总含量比牛乳中的κ-CN和β-CN总含量高24.60%[26-27]，因此，羊乳可以作为牛乳不耐受患者的理想乳源。Park[18]的研究结果发现，山羊乳中αs1-CN占总蛋白的5.6%，而本研究中羊乳粉αs1-CN相对含量均在11%左右，也较杭鑫茹等[22]测定的羊乳粉中αs1-CN的平均含量10%偏高，可能原因是不同单体蛋白含量导致酪蛋白空间结构复杂不一，造成分离羊乳乳清蛋白时酪蛋白的残余量不同。酪蛋白以多种蛋白胶束形式存在，各酪蛋白的稳定性、敏感性不同，造成了在分离乳清蛋白过程中酪蛋白残留的差异[28-29]。同时，纯乳粉乳蛋白中αs1-CN平均相对含量11.77%，配方羊乳粉蛋白中αs1-CN平均相对含量11.36%，二者αs1-CN相对含量无明显差异，表明无论是配方羊乳粉还是纯羊乳粉其致敏蛋白含量都很低。

本研究中配方羊乳粉与纯羊乳粉所含κ-CN、αs2-CN、β-CN及乳清蛋白相对含量均具有明显差异，其中配方羊乳粉乳清蛋白相对含量明显高于纯羊乳粉，而总蛋白质含量较纯羊乳粉明显降低，原因可能与配方羊乳粉额外添加乳清蛋白粉、脱盐乳清粉等有关，在分离乳清过程中，乳球蛋白与酪蛋白之间发生复杂的化学反应，导致产生酪蛋白聚沉物[30]，影响酪蛋白残余量，乳清蛋白粉不但能够增加乳清蛋白相对含量，对其他蛋白质相对含量也有影响[31]。同时，配方羊乳粉中食品添加剂也会对蛋白产生影响，如乳样中添加羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC）后，能够增强蛋白质间的静电排斥作用，提高酪蛋白的稳定性，减少蛋白质间的絮凝作用；且CMC与明胶配合使用后，能明显提高酪蛋白稳定性[32]。因此，配方羊乳粉乳清蛋白含量明显高于纯羊乳粉的主要原因是配方羊乳粉额外添加了食品添加剂。

RP-HPLC是分离纯化的重要方法，在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优良性能，特别适用于分子质量较小的蛋白质和多肽物质的分离纯化，具有十分强大的分辨能力[33]。在分离纯化乳品方面，RP-HPLC有其天然的优势。但是，一种分离手段往往不能达到纯度、数量等方面的要求。因此，应该在现有分离技术的基础上，进一步优化组合，将多种分离手段的优势结合起来，在乳品的分离纯化中发挥更强大的作用，同时，进一步深入研究多种色谱方法，使更复杂多样的乳品样品得到分离。

4 结 论

对市售羊乳粉乳蛋白进行RP-HPLC测定发现，配方羊乳粉αs2-CN和β-CN相对含量分别低于纯羊乳粉20%和24%，κ-CN和乳清蛋白相对含量分别高于纯羊乳粉30%和50%。不同地区纯羊乳粉中乳蛋白组成及含量相似。本研究结果可为市售羊乳粉中乳蛋白检测方法提供借鉴，为不同类型羊乳粉质量评估和品质初步监控提供理论指导和技术支撑。