茶多酚对牛乳过敏原αs1-酪蛋白构象和抗原性的影响

郭红蕾，周胜云，丛艳君,*，闫文杰

（1.北京工商大学食品与健康学院，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；2.北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）

牛乳是国际公认的最常见的过敏性食物之一，牛乳过敏影响了全球2%～3%的幼儿，主要是一种免疫球蛋白E介导的超敏反应[1-2]。与婴儿和儿童相比，青少年和成人患病率更低，这是因为大多数儿童在达到学龄时都会产生耐受性，过敏发病率0.6%左右[3]。目前，牛乳过敏预防措施以避免摄入牛乳过敏原为主[4]，研究有效的抗过敏方法很有必要。αs1-酪蛋白是牛乳中主要过敏原，研究αs1-酪蛋白构象与抗原性的关系具有重要意义[5]。

茶多酚是茶叶中所含的一类多羟基酚类化合物的总称，含量最多的是儿茶素类物质，约占茶多酚总量的60%～80%[6-7]，并以4 种形式存在，分别为表儿茶素（epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）及表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）[8]。其中，EGCG含量约占儿茶素类物质总量的50%，并表现出很强的生物活性，EGC含量约占儿茶素类物质总量的15%～20%[9-11]。茶多酚具有提供质子的能力，具有极强的还原性，因此可以作为一种天然、高效的自由基清除剂，研究表明，茶多酚对人体健康也大有裨益[12-14]，例如，其具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、抑菌、增强机体抵抗力等多种生物活性，因此茶多酚被广泛应用于医药生产、日化、食品加工等领域[15-16]。

有研究表明，茶多酚含有很多活性位点，主要表现在与蛋白质的结合能力上，因此茶多酚和蛋白质的结合也是目前食品领域研究的热点[17]。利用茶多酚改善乳制品的功能特性和感官品质，也是基于茶多酚和乳蛋白的结合能力[18-23]。但是牛乳蛋白和茶多酚结合后，对过敏原的结构和抗原性的影响目前报道较少。本研究通过荧光光谱、同步荧光光谱、圆二色谱、间接竞争酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法及免疫印迹方法研究茶多酚中活性较高的EGCG和EGC对αs1-酪蛋白构象和抗原性的影响，揭示茶多酚的抗过敏机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

αs1-酪蛋白（纯度70%）、EGCG（纯度≥90%）、EGC（纯度≥90%）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺、α-巯基乙醇、甘油、牛血清白蛋白、四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）、二甲基亚砜、氨基黑 美国Sigma公司；低分子质量标准蛋白 天根生化科技（北京）有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠免疫球蛋白G 北京友谊中联公司；抗血清（多克隆抗体）实验室自制；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考马斯亮蓝、甲醇、醋酸、吐温-20、乙醇 国药集团化学试剂有限公司；浓盐酸 北京化学试剂公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过氧化氢、碳酸氢钠 西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

KHB ST-360酶标仪 上海科华实验系统有限公司；SHZ-C水浴恒温振荡器 上海龙跃仪器设备有限公司；BSA124S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SH-2磁力搅拌器 北京东方开物科学器材有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；DYY-7C电泳仪 北京市六一仪器厂；CR22G离心机 日本Hitachi公司；F-7000荧光分光光度计日本日立公司；J-1500圆二色谱仪 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 EGCG-αs1-酪蛋白、EGC-αs1-酪蛋白的制备

以0.1 mol/L、pH 7.0磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）为溶剂，配制1 g/100 mLαs1-酪蛋白溶液、0.02 mol/L EGCG溶液，然后将二者等体积混合，分别于25、50、75、100 ℃温度下反应20 min，以不加EGCG的1 g/100 mLαs1-酪蛋白溶液为空白对照，反应结束后，将样品放置于4 ℃条件下用5 000 Da半透膜进行透析过夜，去除没有与αs1-酪蛋白结合的EGCG，样品置于-20 ℃冰箱中保存备用。

EGC-αs1-酪蛋白的制备方法同上。

1.3.2 荧光光谱和同步荧光光谱测定

通过荧光分光光度计检测EGCG和EGC与αs1-酪蛋白于不同条件下反应得到的产物荧光强度的变化情况。荧光分光光度计发射波长280 nm，扫描波长300～450 nm。同步扫描激发波长220 nm，扫描光谱280～400 nm，间距60 nm。同步扫描激发波长235 nm，扫描光谱250～400 nm，间距15 nm。

1.3.3 圆二色谱测定

用0.05 mol/L、pH 7.4 PBS将样品稀释至蛋白浓度1.0×10-6mol/L，25 ℃下测定其远紫外区的圆二色谱。每份样品测定6 次，取平均值。图谱经过仪器本底消除和溶液空白差减，利用杨氏算法得出αs1-酪蛋白、EGC-αs1-酪蛋白、EGCG-αs1-酪蛋白中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等二级结构的含量。

1.3.4 抗αs1-酪蛋白多克隆抗体制备

参考Peng Juan[24]、Yeung[25]等的方法：取6 只体质量为20～25 g的C3H/He小鼠，将0.2 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合并乳化后，在小鼠背部皮下分6 点免疫；第22天，取0.1 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白和等体积弗氏不完全佐剂乳化至混合物在水中不扩散，小鼠腹腔免疫；第36天，取0.1 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白小鼠腹腔免疫；第50天，取0.2 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白小鼠腹腔免疫；第60天，取6 只小鼠全血，离心制备血清备用。1 只未免疫的小鼠血清为阴性血清，作为对照。

1.3.5αs1-酪蛋白间接竞争ELISA抑制曲线的建立

优化酶标二抗稀释倍数、抗原稀释倍数、抗血清稀释倍数、包被抗原和抗血清反应温度和时间，在底物最佳反应条件基础上，按照间接竞争ELISA程序，于竞争抗原质量浓度0～1 400 ng/mL范围内建立间接竞争ELISA抑制曲线，作该质量浓度范围内的标准曲线。

在450 nm波长处用酶标仪读取光密度（OD450nm），根据OD450nm按照以下公式计算抑制率。

式中：B为梯度稀释的不同质量浓度αs1-酪蛋白作为竞争抗原测得的OD450nm；B0为无αs1-酪蛋白竞争体系测得的OD450nm；B1为未免疫小鼠血清作为一抗测得的OD450nm。

间接竞争ELISA步骤：以αs1-酪蛋白作为包被抗原，用0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将αs1-酪蛋白稀释至5 μg/mL，100 μL/孔加入酶标板中，于4 ℃冰箱中过夜；αs1-酪蛋白抗原与一抗初级反应：在反应管中加入1∶1的αs1-酪蛋白抗原或待测样品（EGCG-αs1-酪蛋白和EGC-αs1-酪蛋白样品）和1∶4 000稀释的鼠多抗，不加αs1-酪蛋白抗原或样品的反应管作为无竞争反应体系，4 ℃冰箱中反应12 h；之后倾去酶标板孔内液体，用200 μL/孔PBST洗板3 次，每次5 min，甩干；加入添加1 g/100 mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBST封闭液进行封闭，每孔100 μL，37 ℃放置1 h，200 μL/孔PBST洗板3 次，每次5 min，甩干；将抗原与一抗混合物以100 μL/孔加入酶标板内，于37 ℃温育2 h；用PBST洗板4 次，200 μL/孔，每次5 min，甩干；用含1 g/100 mL BSA的PBST将HRP-羊抗鼠IgG稀释5 000 倍，以100 μL/孔加入，加盖37 ℃反应1 h；用200 μL/孔PBST洗板3 次，200 μL/孔双蒸水洗板2 次，每次5 min，甩干；加入新鲜配制的TMB应用液100 μL/孔，常温暗处反应25 min，显示蓝色；加入50 μL/孔2 mol/L硫酸终止反应，颜色由蓝变黄，用酶标仪测定OD450nm[26-29]。

1.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

12.5%分离胶、4.5%浓缩胶、胶联度为3.6%，进行垂直电泳，单板恒流10 mA。具体步骤为：αs1-酪蛋白抗原或样品溶液与电泳稀释液以体积比3∶1的比例混合，于沸水浴处理5 min，上样量10 μL。电泳结束后的分离胶用考马斯亮蓝R-250染色15 min，显现蛋白条带，以低相对分子质量标准蛋白为标准，用凝胶成像系统分析其相对分子质量。

1.3.7 免疫印迹鉴定

首先进行SDS-PAGE，然后将胶上的蛋白转印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，将膜用加样梳、铅笔作标记，将PVDF膜剪裁，与SDSPAGE凝胶中分离胶大小一样，再将PVDF膜、滤纸和海绵一同浸泡于电极缓冲液（含20%甲醇的Tris缓冲溶液）中30～60 min。将电泳完毕的SDS-PAGE分离胶取下，放入电转缓冲液中平衡20～30 min，在干净、平整的实验台上按以下顺序从正极到负极铺于凝胶夹上：凝胶夹板→海绵→3 层滤纸→PVDF膜→凝胶→3 层滤纸→海绵→凝胶夹板（此过程中应避免气泡产生，用光滑的玻璃棒从一侧向另一侧慢慢滚动，赶出气泡），夹紧“凝胶三明治”插入转移电泳槽，灌满缓冲液。将PVDF膜端靠近正极，凝胶面靠近负极，打开电源，定流192 mA，电转移4.0 h。转印后的PVDF膜一式两份，1 份用氨基黑10B溶液染色5 min，脱色5 min，观察转印效果及蛋白质位置，另1 份用于免疫印迹。

将转印后的PVDF膜于大小合适的平皿中用dH2O洗涤5 min，再用TBST溶液（添加体积分数0.05%吐温-20的pH 7.4 Tris缓冲溶液）于37 ℃下漂洗4 次，每次15 min。加入10～20 mL封闭液平皿中，于37 ℃下孵育1 h，封闭PVDF膜，然后用dH2O洗涤5 min。将PVDF膜与1∶4 000稀释的多抗于37 ℃孵育2 h，再用dH2O洗涤5 min，用TBST溶液洗涤3 次，每次10 min。将PVDF膜与HRP标记羊抗鼠二抗（1∶5 000稀释）于37 ℃孵育1 h，再用dH2O洗涤5 min，TBST溶液洗涤3 次，每次10 min。将漂洗后的PVDF膜浸没在新鲜配制的0.05 mol/L 4-氯-1-萘酚底物溶液中，显色（37 ℃、35～40 min），待蛋白带显色清晰，即可用dH2O漂洗，终止反应。用dH2O冲净PVDF膜，置于双层滤纸中风干保存[30-31]。

1.4 数据处理

所有实验均做3 个平行，3 次重复。用Excel 2013软件绘制图表，SPSS 17.0软件进行数据分析，采用Duncan’s multiple range test方法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱和同步荧光光谱分析结果

由图1可知，经EGC和EGCG处理的αs1-酪蛋白的荧光发射强度有所减弱，EGC和EGCG均对αs1-酪蛋白内部荧光有猝灭作用，EGCG几乎完全猝灭αs1-酪蛋白的内部荧光，EGC对αs1-酪蛋白内部荧光的猝灭效率低于EGCG。表明EGC和EGCG分别与αs1-酪蛋白相互结合，覆盖在αs1-酪蛋白的表面。

图1 EGC和EGCG对αs1-酪蛋白的荧光猝灭图谱Fig. 1 Fluorescence quenching effect of EGC and EGCG on αs1-casein

为深入探究αs1-酪蛋白与EGCG、EGC结合前后蛋白构象的变化，进一步通过同步荧光光谱进行分析。从同步荧光光谱图中可获得生色基团分子周围的结构情况。αs1-酪蛋白的荧光主要来自酪氨酸（tyrosine，Tyr）、色氨酸（tryptophan，Trp）和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）。当Δλ=15 nm时，只能得出Tyr荧光的特征光谱；当Δλ=60 nm时，只能得出Trp荧光的特征光谱，因此可以通过发射波长和扫描波长范围的改变推断Tyr和Trp残基周围结构的变化情况，进而推断出αs1-酪蛋白构象的变化[32]。

由图2可知，经EGC和EGCG处理的αs1-酪蛋白中Tyr的荧光发射强度有所降低，其最大发射峰发生蓝移（分别为2、5 nm），说明EGC和EGCG与αs1-酪蛋白结合后对αs1-酪蛋白中Tyr残基的周围结构有影响。且与αs1-酪蛋白结合后，EGCG相比EGC对αs1-酪蛋白中Tyr残基周围环境的影响更大。

图2 EGCG和EGC结合αs1-酪蛋白在Δλ=15 nm时的同步荧光图谱Fig. 2 Synchronous fluorescence spectra of interaction of αs1-casein with EGCG and EGC at Δλ = 15 nm

由图3可知，经EGC和EGCG处理的αs1-酪蛋白中Trp的荧光发射强度有所降低，其最大发射峰发生红移（分别为1、2 nm），说明EGC和EGCG与αs1-酪蛋白结合后对αs1-酪蛋白中Trp残基的周围结构有影响。且与αs1-酪蛋白结合后，EGCG相比EGC对αs1-酪蛋白中Trp残基周围环境的影响更大。

图3 EGCG和EGC结合αs1-酪蛋白在Δλ=60 nm的同步荧光图谱Fig. 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction of αs1-casein with EGCG and EGC at Δλ = 60 nm

荧光光谱和同步荧光光谱结果表明，随着EGCG和EGC与αs1-酪蛋白的结合，αs1-酪蛋白发光基团的荧光强度有所降低。EGCG和EGC结合到αs1-酪蛋白上对αs1-酪蛋白的Tyr和Trp残基均有影响，推测EGCG和EGC与αs1-酪蛋白的Tyr和Trp残基本身结合或者与Tyr和Trp附近的结构相结合[33]，同时，其对Trp残基的影响强于Tyr残基，但是具体的结合位置需要深入探究。

2.2 圆二色谱分析结果

蛋白质的二级结构有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲4 种类型，不同类型所产生圆二色谱带吸收的位置和强弱不同。圆二色谱中，192 nm波长附近α-螺旋结构有1 个正特征峰谱带，波长208、222 nm附近有2 个负谱带，同时在波长222 nm附近的摩尔椭圆度（θ）绝对值越大，则蛋白中α-螺旋结构也越多；波长185～200 nm附近β-折叠有1 个正峰，波长216 nm附近有1 个负峰；波长206 nm附近β-转角有1 个正峰。因此，可以通过分析蛋白质样品的圆二色谱图，推测其二级结构组成。

由图4～5可知：样品的圆二色谱显示，在208～212 nm和218～222 nm附近有峰存在，这是α-螺旋结构的典型特征，说明有α-螺旋产生；在波长224～230 nm附近有微弱且较宽的谱带，说明存在β-折叠或富含L-脯氨酸序列的区域。EGCG-αs1-酪蛋白复合物和EGC-αs1-酪蛋白复合物在波长222 nm附近的θ绝对值比天然αs1-酪蛋白略大，表明EGCG和EGC结合αs1-酪蛋白后，αs1-酪蛋白中α-螺旋结构可能有所增加。整体而言，与天然αs1-酪蛋白的圆二色谱相比，EGCG-αs1-酪蛋白复合物的圆二色谱曲线变化比EGC-αs1-酪蛋白略大，表明EGCG结合后对αs1-酪蛋白二级结构的影响比EGC明显。

图4 不同处理的αs1-酪蛋白和EGC-αs1-酪蛋白的圆二色谱Fig. 4 CD spectra of free αs1-casein and EGC-αs1-casein

图5 不同处理的αs1-酪蛋白和EGCG-αs1-酪蛋白的圆二色谱Fig. 5 CD spectra of free αs1-casein and EGCG-αs1-casein

由表1可知，αs1-酪蛋白结合EGC和EGCG后其构象均有变化，α-螺旋和β-折叠含量略有增加，无规卷曲含量略有降低，并且EGCG对αs1-酪蛋白二级结构的影响比EGC略大。但是，EGC-αs1-酪蛋白和EGCG-αs1-酪蛋白较αs1-酪蛋白的二级结构变化并不显著。然而，因圆二色谱分析结果算法较多，且算法原理不同，导致结果有较大差异，圆二色谱的分析结果只能作为参考。Hasni等[34]发现，茶多酚的结合改变了牛乳酪蛋白的二级结构，导致无规卷曲和β-转角数量增加，而α-螺旋和β-折叠数量减少。

表1 αs1-酪蛋白、EGCG-αs1-酪蛋白和EGC-αs1-酪蛋白的二级结构含量Table 1 Secondary structure composition of free αs1-casein, EGCG-αs1-casein and EGC-αs1-casein %

2.3 αs1-酪蛋白间接竞争ELISA竞争抑制曲线

为进一步研究茶多酚对αs1-酪蛋白抗原性的影响，建立αs1-酪蛋白间接竞争ELISA方法。优化条件为酶标二抗稀释倍数1∶5 000、抗原稀释为质量浓度5 μg/mL、抗血清稀释倍数1∶4 000，包被抗原和抗血清37 ℃条件下反应2 h，底物最适反应条件为25 ℃、25 min。基于优化结果，绘制间接竞争ELISA抑制曲线。由图6可知，竞争抗原（αs1-酪蛋白）质量浓度0～1 400 ng/mL范围内，抑制率与竞争抗原质量浓度具有较好的线性关系，曲线方程为y=-0.019 5x+93.938 0（R2=0.989 2）。

图6 αs1-酪蛋白间接竞争ELISA竞争抑制曲线Fig. 6 Competitive inhibition curve of ic-ELISA for αs1-casein

2.4 间接竞争ELISA检测结果

通过间接竞争ELISA检测不同反应温度下得到的EGCG-αs1-酪蛋白、EGC-αs1-酪蛋白复合物的αs1-酪蛋白残留量。由图7可知，αs1-酪蛋白与EGCG分别于25、50、75、100 ℃反应20 min，所得复合物的αs1-酪蛋白残留量差异极显著（P＜0.01），其中αs1-酪蛋白残留量最高的条件为25 ℃处理20 min，为（3 720.39±0.93） ng/mL，残留量最低的条件为100 ℃处理20 min，为（3 589.72±0.61） ng/mL。αs1-酪蛋白与EGC分别于25、50、75、100 ℃反应20 min，所得复合物的αs1-酪蛋白残留量差异极显著（P＜0.01），其中αs1-酪蛋白残留量最高的条件为25 ℃处理20 min，为（3 979.27±0.97） ng/mL，残留量最低的条件为100 ℃处理20 min，为（3 895.44±1.53） ng/mL。另外，αs1-酪蛋白分别与EGCG、EGC于25、50、75、100 ℃反应20 min，所得复合物的αs1-酪蛋白残留量差异均极显著（P＜0.01），并且其中αs1-酪蛋白残留量最低的条件均为与EGCG发生反应，分别为（3 720.39±1.04）、（3 643.96±0.49）、（3 710.53±0.93）、（3 589.72±0.61）ng/mL，未经茶多酚处理的αs1-酪蛋白残留量最高。因此可以得出，αs1-酪蛋白经EGCG和EGC接枝后，其免疫原性减弱。

图7 EGCG和EGC对αs1-酪蛋白残留量的影响Fig. 7 Effects of EGCG and EGC on the residual quantity of αs1-casein

茶多酚与牛乳蛋白可通过氢键、疏水键和范德华力等结合，形成多酚-蛋白质偶联物[35]。因此推测本研究EGCG、EGC与αs1-酪蛋白结合后，可能修饰了αs1-酪蛋白作用表位的氨基酸结构，进而降低了免疫原性。吴序栎[36]通过EGCG和EGC接枝β-乳球蛋白，结果显示，β-乳球蛋白分别与EGCG、EGC结合后，二者与多克隆抗体的结合能力均有所降低，且EGCG的效果比EGC明显，与本研究结论较一致。

2.5 SDS-PAGE结果

由图8可知，αs1-酪蛋白分别与EGCG和EGC于不同温度下反应相同时间，得到的复合物分子质量没有变化，这与EGCG和EGC为小分子化合物有关。

图8 茶多酚接枝αs1-酪蛋白电泳图Fig. 8 Electrophoretogram of αs1- casein grafted with tea polyphenols

2.6 免疫印迹鉴定结果

由图9可知，阴性血清与经茶多酚接枝后的αs1-酪蛋白未发生反应，表明小鼠多克隆抗体与经茶多酚接枝后的αs1-酪蛋白发生特异性免疫反应。

图9 αs1-酪蛋白及其复合物免疫印迹谱图Fig. 9 Western blot patterns of αs1-casein and its complexes

3 结 论

茶多酚中的EGCG、EGC与αs1-酪蛋白接枝后，对αs1-酪蛋白内部荧光有猝灭作用，与EGCG相比，EGC对αs1-酪蛋白内部荧光的猝灭效率低于EGCG；对αs1-酪蛋白的Tyr和Trp残基均有影响，对Trp残基荧光的影响强于Tyr残基，但是具体的结合位置需要深入研究；αs1-酪蛋白的α-螺旋和β-折叠含量略有增加，无规卷曲含量略有降低。间接竞争ELISA方法发现，EGCG、EGC均使αs1-酪蛋白的抗原性显著降低，但是免疫印迹实验中小鼠多克隆抗体依然与EGCG-αs1-酪蛋白、EGC-αs1-酪蛋白复合物发生特异性免疫反应，建议进一步通过动物实验揭示其致敏机制。本研究结论可以为低致敏乳制品开发提供重要的理论依据和思路。