P2RY8在肝细胞癌组织中表达的生物信息学分析及其临床意义

梅儒齐， 鞠 倩， 李曰平， 刘诚聪

1 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所重症医学科， 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142； 2 青岛市中心医院 胃肠外科， 山东 青岛 266000

原发性肝癌是癌症相关死亡的第二大原因，全球发病率不断上升[1]。肝细胞癌(HCC)是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤，占所有原发性肝癌的70%～80%[1-2]。早期HCC可以通过肝切除术或肝移植治疗，然而多数患者在诊断时已是晚期，已不适合行手术治疗[3-5]。即使在根治性手术切除后，由于较高的复发率，肝癌患者的5年生存率仍然很低[6]。肝脏是一种“免疫特惠”器官，多种来自肠道的抗原汇集于门静脉须经肝脏代谢。为避免过度免疫反应，肝脏中的免疫细胞不及其他组织器官活跃，且慢性病毒性肝炎使肝脏免疫系统处于耐受状态。这为起源于肝脏的恶性肿瘤发生免疫逃逸提供了天然环境。因此，理论上HCC是免疫治疗的优势肿瘤。近年来，PD-1/PD-L1单克隆抗体等免疫检查点抑制剂 (immune checkpoint lnhibitor,ICI)治疗HCC的临床研究开展得如火如荼[7-8]，纳武利尤单克隆抗体客观有效率和总体生存时间分别为22.5%和28.6个月，优于索拉非尼耐药组[7]。因此，美国食品药品监督管理局优先批准纳武利尤单克隆抗体为晚期HCC的二线治疗药物。而另外一项纳武利尤单克隆抗体[8]和帕博利珠单克隆抗体[9]作为HCC一、二线治疗的Ⅲ期临床研究尚未达到主要终点。因此，在治疗前确定患者对免疫治疗的敏感性是很重要的。

人B淋巴细胞限制受体P2RY8是一种Gα13蛋白偶联受体，由生发中心B淋巴细胞和滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh)高度表达[10-11]。生发中心是抗体多样化和亲和力成熟的重要部位，也是B淋巴细胞恶性肿瘤的常见来源，被限制在B淋巴细胞滤泡内。含Gα13的异三聚体G蛋白通过P2RY8的下游信号传导，促进B淋巴细胞向生发中心外迁移[12]。P2RY8通过耦联Gα13抑制淋巴组织中B淋巴细胞迁移，同时调节B淋巴细胞生长[10-12]。P2RY8在人淋巴细胞和其他一些免疫细胞类型中也有广泛的表达，介导其在生发中心以外的功能。淋巴细胞中的Gα13激活ArhGEF1，从而激活Rho并抑制细胞向化学吸引剂的迁移[13]。

近年来，P2RY8在血液系统肿瘤发生发展中的作用得到了重视[14-15]，而在实体瘤尤其是HCC中的表达和临床价值尚不清楚。 TCGA数据库通(https://portal.gdc.com)过应用高通量的基因组分析技术，创建一个较全面的癌症基因组图谱，从而提高对癌症的预防、诊断和治疗能力[16]。本实验利用TCGA数据库，对HCC患者样本P2RY8表达与临床病理特征的相关性进行数据挖掘，结合免疫组化研究结果，进一步探讨P2RY8在HCC发生发展中的作用，为HCC防治提供新的理论依据及潜在的生物靶点，以期让更多患者受益。

1 材料与方法

1.1 P2RY8表达水平的比较 从TCGA数据库下载21种人类癌症(包括424例HCC组织，50个HCC组织以及50个与其配对的相邻正常肝组织)的P2RY8的RNA序列(P≤0.05，| log2FC |≥ 2)。使用R软件包limma对标准化后的数据进行P2RY8差异表达分析。为进一步明确P2RY8表达在肝癌患者中的分布是否具特异性，笔者收集来自于GEO数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的数据集GSE58208(慢性乙型肝炎患者12例，健康对照者5例)，下载数据格式为MINiML。

1.2 P2RY8与肿瘤分期及预后的相关性分析 采用ggplot2包的R软件进行P2RY8表达与肿瘤分期(TNM分期、病理分期、组织学分级)的相关性分析。绘制Kaplan-Meier图计算生存率，使用生存包进行log-rank检验估计生存率差异，P<0.05为差异有统计学意义。使用R软件包(pROC、timeROC和survival包)建立诊断受试者工作特征(ROC)曲线、诊断时间依赖曲线和Nomogram模型分析。本节使用的临床数据同样取自TCGA数据库。

1.3 P2RY8与HCC组织中免疫细胞浸润的相关性分析

采用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析HCC中P2RY8表达与免疫细胞浸润丰度及免疫细胞标志物的相关性。此外，TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3和PDCD1LG2是与免疫检查点相关的转录本，提取这7个基因的表达值，使用TIMER和基于TCGA的ggplot2包的R软件来评估HCC中P2RY8表达与免疫检查点的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

1.4 对P2RY8进行GO功能富集、KEGG通路富集和基因集富集分析 GO分析和KEGG分析使用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)获取HSPA4的PPI网络信息。当蛋白相互作用评分在0.9以上时，认为有统计学意义。从分子功能、生物学过程、细胞组分3个方面来进行GO富集分析。通过对20个互作基因进行GO富集和KEGG通路分析来探讨P2RY8的生物学功能。

此外，应用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)来评估先前定义的一组基因在两种生物状态之间是否具有统计学上显著且一致的差异。根据TCGA数据库下载的数据，将肿瘤样本分为P2RY8低表达组和高表达组。应用R软件集群Profiler(版本3.6.0)执行GSEA，使用MSigDB Collections of c2(c2.all.v7.2.symbols.gmt)运行。校正后P<0.05和q值(错误发现率，FDR)<0.25可认定为显著富集。

1.5 临床数据验证

1.5.1 研究对象 从2007年6月—2008年11月行肝癌根治性手术的64例HCC患者中获取肿瘤组织及其中35例对应的癌旁组织(组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司)，并统计其临床资料及随访资料，临床资料包括性别、年龄、AFP、TBil、Alb、ALT、GGT、HBV及HCV感染史、肝硬化与否、肿瘤直径、肿瘤数目、TNM分期等。随访截止时间为2016年2月。手术后至死亡或最后随访时间定义为总生存时间。随访资料包括1、3、5年生存率，无进展生存期(PFS)，总生存时间(OS)等。

1.5.2 免疫组化染色及评分 组织标本经二甲苯和分级醇脱蜡后，在EDTA溶液中进行热诱导表位提取步骤。然后用1%的BSA封闭30 min，与抗P2RY8抗体(bs-12073R, 博奥森生物技术有限公司，北京)在4 °C孵育过夜，然后与hrp标记的山羊抗小鼠IgG抗体在37 °C孵育30 min。使用3,30 -二氨基联苯胺(DAB，中山金桥生物技术有限公司，北京)和苏木紫染色检测免疫反应。染色结果判定：P2RY8阳性染色主要集中在细胞质中。染色强度评分：无染色为0分，微弱染色(淡黄色)为1分，中等染色(棕黄色)为2分，强染色(棕褐色)为3分。阳性染色比例评分：阳性染色细胞占比0～5%计0分，6%～30%计1分，31%～50%计2分，51%～70%计3分，≥71%计4分。染色结果判定总分=染色强度分值×阳性染色比例分值。总分为0分计为阴性表达，1～2分为弱阳性表达，3～6分为中阳性表达，>6分为强阳性表达。总评分>3分定义为 P2RY8高表达组织，总评分≤3分定义为P2RY8低表达组织。

2 结果

2.1 P2RY8表达的泛癌分析 为了探索P2RY8在癌症发生中的可能作用，首先分析了其在21种人类癌症中的表达水平。如附录1a所示，与正常组织相比，P2RY8在胆管癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、HCC这5种肿瘤类型中均显著上调；在膀胱尿路上皮癌、结肠癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌、肺鳞癌、直肠腺癌、子宫内膜癌这7种肿瘤中均显著下调；然而，P2RY8在乳腺浸润癌、宫颈鳞癌和腺癌、食管癌、肺腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、胃癌、甲状腺癌中无显著差异。附录1b和1c也分别表明了P2RY8在HCC中高表达。

此外，为了探索P2RY8在HCC中的表达是否具有特异性，笔者还分析了来自于GEO数据库中12例慢性乙型肝炎患者与5例健康对照者中P2RY8表达的分布差异，结果显示分布无统计学差异(P=0.44)。

2.2 P2RY8表达与肿瘤分期及肿瘤预后相关性 T分期、N分期、M分期、TNM分期在P2RY8高表达组与低表达组之间分布均无统计学差异(图1a～d)。然而，Kaplan-Meier生存曲线显示，P2RY8高表达的HCC患者预后较好，OS(P=0.005)、疾病特异性生存期(P=0.04)、无进展间期(P=0.042)均提示高表达的患者获得更加良好的预后(图2a～c)。进一步的单因素和多因素分析也表明P2RY8水平是HCC预后的独立预测因素(表1，图2d)。

2.3 P2RY8表达在诊断和预测预后中的价值 从诊断方面的ROC曲线来看，通过分析P2RY8表达水平能够准确地从正常组织中鉴别肿瘤(AUC=0.794)(图3a)。通过建立P2RY8的时间依赖生存ROC曲线来预测1、3、5年生存率(图3b)。结合临床病理因素(T、N、M分期)和P2RY8水平，建立Nomogram模型，预测临床患者1、3、5年生存概率(图3c)，均获得了不错的效果。

图1 P2RY8表达与HCC分期的关系

表1 TCGA数据库中HCC的单因素和多因素生存分析Table 1 Univariate and multivariate survival analysis of hepatocellular carcinoma

注：a，诊断区分肿瘤与正常组织的ROC曲线；b，时间依赖生存ROC曲线分析预测1、3、5年生存率；c，Nomogram模型，结合临床分期和P2RY8水平预测1、3、5年生存率。

2.4 P2RY8表达与HCC肿瘤免疫细胞浸润水平的相关性 Kaplan-Meier生存曲线显示P2RY8高表达与更好的预后相关，接下来利用TCGA和TIMER数据库探索P2RY8表达与HCC免疫细胞(B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、树突状细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)浸润丰度之间的关系。使用R语言整体分析，结果发现P2RY8表达水平与HCC组织中多种免疫细胞浸润程度呈正相关(0

2.5 HCC中P2RY8表达与免疫检查点的关系 进一步利用TIMER数据库和TCGA数据库分别检测HCC组织中P2RY8表达与PD-1(附录2a、c)和CTLA-4(附录2b、d)表达的相关性，结果表明均呈正相关。TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3和PDCD1LG2是与免疫检查点相关的转录本[17]，提取这7个基因的表达值，观察免疫检查点相关基因的表达情况。P2RY8与各免疫检查点基因表达水平在HCC中呈显著正相关(附录2e)。此外，通过泛癌分析发现，在除肾上腺皮质癌及葡萄膜黑色素瘤之外的其他各个肿瘤中，P2RY8表达水平与多种免疫细胞浸润程度呈明显相关(附录2f)。

图4 HCC中P2RY8与免疫细胞浸润相关性的棒棒糖图Figure 4 Correlations between P2RY8 expression levelsand immune cell infiltration in hepatocellular carcinoma

2.6 HCC中P2RY8表达与ICI治疗的关系 基于表达谱数据，利用肿瘤免疫功能障碍与排除(TIDE)算法预测单个样本或者某亚型对预测ICI响应性[18]。TIDE使用一组基因表达标记来评估2种不同的肿瘤免疫逃逸机制，包括肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞的功能障碍和免疫抑制因子对细胞毒性T淋巴细胞的排斥。结果显示，P2RY8低表达者TIDE评分低，ICI治疗效果好，接受ICI治疗后将获得更长的生存期(图5)。

2.7 HCC中P2RY8相关基因网络的建立 为了进一步了解HCC患者中与P2RY8表达相关的可能相关基因，笔者查找了与P2RY8呈正相关或负相关的前20个基因。基于STRING构建了这些基因的相互作用网络(附录3a)。接下来进行GO和KEGG富集分析，了解P2RY8在HCC中潜在的生物学功能。GO分析显示，P2RY8在主要的生物过程(循环免疫球蛋白介导的体液免疫反应，补体激活，T淋巴细胞、B淋巴细胞、免疫球蛋白介导的免疫)、细胞组分(免疫球蛋白复合物、T淋巴细胞受体复合物)和分子功能(抗原结合、免疫球蛋白受体结合)均有不同程度的富集(附录3b、d)。KEGG通路分析表明，细胞因子-细胞因子受体相互作用，原发性免疫缺陷通路明显富集于P2RY8共表达基因(附录3b、c)。此外，进行GSEA以基于游离富集评分(NES)和FDR(假发现率)q值，阐明P2RY8在P2RY8高表达组与低表达组之间可能调节的生物学途径。如附录3d所示，P2RY8高表达组在受体相互作用通路、细胞周期检查点通路等几种信号通路显著富集。

表2 HCC中P2RY8表达与免疫细胞标志物的相关性分析Table 2 Correlation analysis of P2RY8 expression andimmune cell markers in hepatocellular carcinoma

图5 预测P2RY8高表达组与低表达组间免疫反应得分的分布情况

2.8 64例HCC患者的临床资料特征、P2RY8的表达水平及预后 在64例HCC组织中，24例P2RY8呈强阳性表达，22例呈中阳性表达，12例呈弱阳性表达，阳性表达率为90.6%；对应的35例癌旁组织中，26例呈强阳性表达，4例呈中阳性表达，阳性表达率为85.7%。与癌旁组织相比，HCC组织中P2RY8阳性表达率明显高于癌旁组织(χ2=7.352，P=0.007)(图6)。

本研究同时分析了P2RY8表达水平与各项临床数据之间的关系。如表3所示，将64例HCC患者根据P2RY8表达水平分为高低两组，其中年龄、性别、AFP、AST、GGT、TBil、Alb及肿瘤数目组间分布无统计学差异(P值均>0.05)；而P2RY8高表达的HCC患者肿瘤最大直径相对较小，具有统计学意义(P=0.002)。同样发现两组患者的肿瘤TNM分期差异无统计学意义(P>0.05)，这与之前生信分析中的结论相符。

针对预后，从1、3、5年生存率、PFS及OS 5个层面分析与P2RY8表达水平之间的关系。结果显示，P2RY8高表达的肝癌患者术后3、5年生存率和OS显著高于低表达者(P值均<0.05)；而1年生存率及PFS也存在相应趋势，但差异无统计学意义(表3)。这可能与研究样本量较少有关。

Kaplan-Meier生存曲线进一步分析发现，P2RY8高表达的HCC患者总生存期明显高于低表达者(P=0.004)(图7)。本研究结果有效验证了之前的结论，即通过检测P2RY8表达水平可预测HCC患者术后的预后状况。

注：a，阴性表达；b，弱阳性表达；c，中阳性表达；d，强阳性表达。

图7 64例HCC患者P2RY8表达水平与术后总生存期的Kaplan-Meier生存曲线分析

3 讨论

HCC由于其隐匿性及侵袭性，在早期诊断及治疗方面颇为棘手。本研究通过TCGA数据库分析发现，P2RY8在HCC中与正常肝组织相比呈高表达。HCC组织中P2RY8表达水平与TNM分期无明显相关，而进一步的生存和预后分析中P2RY8高表达的HCC患者远期生存率显著提高，是良好预后的独立影响因素。通过P2RY8表达水平能够很好地区分肿瘤和正常组织，预测1、3、5年生存率，提示P2RY8可能是一种潜在有价值的HCC早期诊断和预后的生物标志物。笔者进一步的临床数据分析也验证了这一想法。

肿瘤免疫在肿瘤的发生、发展、复发及转归中起着至关重要的作用，以其作为靶点的肿瘤免疫治疗是近年来抗肿瘤治疗的新兴中坚力量[17-18]。免疫检查点，包括刺激和抑制检查点分子，作为免疫系统的关键调节因子，在自体耐受和细胞免疫中的作用不容小觑。因此，为了探索P2RY8与HCC良好预后相关性的可能原因，本研究从免疫细胞浸润及免疫检查点方面入手，分析结果表明在HCC中，P2RY8表达水平与绝大多数免疫细胞浸润程度呈正相关，而7个免疫检查点也均与P2RY8表达水平呈正相关。进一步泛癌分析发现，P2RY8表达在多种类型肿瘤组织中与免疫细胞浸润程度均呈正相关。这提示P2RY8可能通过调节多种免疫细胞群来调控HCC免疫。行TIDE评分显示P2RY8低表达者TIDE评分低，提示P2RY8低表达者在接受ICI治疗之后便可获得较好的疗效，从而获得更大的生存获益。

表3 64例HCC患者中P2RY8表达水平与临床特征及预后之间的关系Table 3 The relationship between P2RY8 expression level and clinical characteristics and outcomes in 64 HCC patients

此外，GO/KEGG分析结果提示P2RY8与循环免疫球蛋白介导的体液免疫反应、T淋巴细胞、B淋巴细胞及免疫球蛋白介导的免疫相关，进一步GSEA分析发现P2RY8与受体相互作用通路显著富集，与笔者前面的生信研究结论相符。HCC组织中P2RY8表达水平上升，通过诱导免疫细胞浸润，从而达到抗肿瘤效果。这可能是P2RY8高表达的HCC患者预后较好的原因之一。

He等[19]研究表明P2RY8的表达下调与系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病有关。之前有研究[19-20]发现P2RY8的表达减少了小鼠模型中DNA反应性滤泡B淋巴细胞的积累，说明P2RY8可能对这种耐受检查点很重要。另一方面，P2RY8发生突变的B淋巴细胞可在抗体反应的各个阶段中发生去调节迁移，从而提高了自身免疫性疾病的发病率[21-22]。本研究结果也同样证明P2RY8广泛参与了免疫反应的各个阶段，至于是如何通过调节免疫影响肿瘤临床结果，有待进一步实验室探索和临床研究来验证。

综上所述，本研究利用生物信息学方法验证了P2RY8在HCC诊断和预后判断中的价值，并结合临床样本进一步验证，使得结论更具有说服力。本研究发现，P2RY8可能不仅参与HCC的发生、发展，还参与了HCC的免疫调节。因此，P2RY8可以作为一种潜在的HCC诊断和预后的生物标志物和治疗靶点。P2RY8功能的预测为进一步研究HCC的发病机制以及P2RY8在HCC免疫治疗中的作用提供了新的思路。未来需要进一步的相关机制研究来验证笔者的发现并促进其临床应用。

同时，本研究存在一些局限性。首先，从公共数据库检索出的生信分析数据及用作验证的临床样本均为回顾性研究，未来需要进一步前瞻性研究来证实。其次，本研究用于外部验证的临床样本量偏少。此外，尽管在不同的肿瘤中发现了P2RY8与免疫细胞浸润密切相关，具体机制尚不明确，仍需进一步的机制研究来探索。

伦理学声明：本研究方案于2017年1月6日经由上海芯超生物科技有限公司伦理委员会审批，批号：SHYJS-CP-1701002，所纳入患者均签署知情同意书。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：梅儒齐负责课题设计，资料分析，撰写论文；梅儒齐、鞠倩、李曰平参与收集数据，修改论文；刘诚聪负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。

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