海南铜鼓岭热带季雨矮林树干附生地衣及其内生真菌多样性的研究

李英英 郑云柯 王祝年

（1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 海南海口 571101；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所 海南海口 571101）

铜鼓岭国家级自然保护区位于海南岛东北部的 文 昌 市 内 ， 地 理 坐 标 为 E 110°58′30″～111°03′00″，N 19°36′54″～19°41′21″，保护区总面积为44 km2，其中陆地面积为13.33 km2，海域面积为30.67 km2，核心区500 hm2。铜鼓岭保护区属于热带海洋性岛屿季风气候区，具有全年无霜、雨量充沛、干湿季节分明、日照充足等特点；年平均气温23.9℃，全年日照时数为2 137 h，年均降雨量为1 721.6 mm，年均蒸发量为1 872.7 mm。东北风为该区常年的主导风向，年平均风速为2.8 m/s；东南向波浪为常波浪，海域风浪常以 3级风浪为主。铜鼓岭保护区土壤以砖红壤为主，其土层浅薄，土壤发育程度相对较低；迎海面土壤较为湿润，背海面岩石的裸露面积大，土壤含水量较低；水系不发达，由于山区面积较小、坡度大、土层薄，集水条件差，因此铜鼓岭山地冲沟多为干涸或间歇沟，且东西向多呈平行并近似垂直于山体走向分布，地表经流分别向东注入南海，向西流入堆积平原[1]。铜鼓岭的水热气候因素为该区植被的生长发育提供了有利条件，保护区内植被茂密，植物资源丰富；由于受到海陆风和海潮的影响，铜鼓岭地区的植被呈明显的垂直分布和水平分布规律，植被类型随着海拔和阶地、坡向的不同，有很大的区别。从滨海沼泽、沙滩、阶地至山麓和丘陵依次分布有滨海沙生植被、山麓灌木林、红树林、热带常绿季雨矮林及局部人工栽培的人工林等植被类型，其中顶级植被类型为热带常绿季雨矮林[2-5]。基于铜鼓岭自然保护区内热带季雨矮林的特殊性，较多的学者对该森林生态系统开展研究，但截至目前，尚未发现针对该保护区内地衣多样性的相关研究，本次调查弥补了该区地衣相关研究的空白。

地衣是一类由真菌和绿藻或蓝细菌组成的可进行无性或有性繁殖的共生生物体，而此类与特定的藻类或蓝细菌处于稳定共生联合状态的专化性真菌在形成的地衣共生体中占据重要优势地位；真菌是地衣体的主要成员，它决定了地衣体的形态结构特征，且地衣的有性生殖过程就是真菌的生殖过程，所以地衣又称为地衣型真菌(lichenied fungi)[6]。构成地衣的真菌称为地衣型真菌，而生长于地衣菌丝体内的非地衣型真菌也是一个庞大的类群，此类真菌被称为地衣内生真菌（endolichenic fungi）[7]。内生真菌是指在其自身生活史中的某一个阶段存在于健康的植物组织内部，但不会引起宿主明显病症或不会对宿主造成明显伤害的真菌[8]。地衣是森林生态系统中附生生物的重要组成部分，不仅能维持森林生态系统中物种的多样性和完整性，对于林中环境的变化也具有检测能力；另外，由于地衣耐寒、耐旱，且对生境的营养成分要求不高，所以分布十分广泛。与此同时，作为先锋植物的地衣，在森林群落原生演替过程中，对于土壤的形成和群落中环境条件的改善也起着至关重要的作用[9]。

本次考察对保护区内森林群落中重要值排名前 20的相关树种[10]树干上附生地衣进行采集，并通过分子生物学技术对地衣及其内生真菌进行分类学鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

对铜鼓岭自然保护区内重要值前 20的树种（表1）进行树干附生地衣的采样，共采集地衣样品252份。

表1 热带季雨矮林重要值前20的树种名录

1.2 方法

1.2.1 PCR 扩增利用改良的 CTAB法[11]提取地衣的总DNA，以通用引物ITS1F(5‘-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’)和 ITS4(5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)对真菌的 rDNA ITS区段进行PCR扩增[12]。

PCR 反应体系：10×Taq buffer缓冲液 2.5 μL，10 mmol/L 的 d NTP 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、引物 ITS4(10 μmol/L)和 ITS4(10 μmol/L)各 0.5 μL，BSA 溶液 2 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 17.5 μL，总体积 25 μL。PCR 反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸55 s，循环30次；72℃延伸10min；4℃保存。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像仪分析条带。割胶回收条带清晰的样品，将纯化后的样品送北京诺赛基因测序公司测序。

1.2.2 数据处理与分析利用BioEdit 5.0.6对序列测序结果进行手工校正，将获得的正确序列在NCBI数据库中进行同源比对搜索，确定与本实验克隆亲缘关系最近的种属名称；挑选亲缘关系相近的参考序列，采用MEGA 5.0软件进行系统发育分析及系统发育树构建。

2 结果与分析

2.1 地衣型真菌种类

对地衣型真菌样品的阳性克隆进行测序，将所获得的 rDNA-ITS片段在 NCBI数据库中进行Blast比对，结果见表2，同时对具有较高同源性的参考序列共同构建系统发育树（图1）。可以看出，此次调查共发现8科13属26种地衣型真菌，其中担子菌门1种，子囊菌门25种。

图1 地衣序列进化树

表2 真菌序列与GenBank数据库中克隆序列比对结果

2.2 地衣内生真菌种类

对地衣内生真菌样品进行DNA提取克隆，测序阳性克隆，将目的序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析，结果见表3。根据表3可将内生真菌分为担子菌门和子囊菌门两大类，对具有较高同源性的参考序列共同构建系统发育树（图2、3）。此次调查共发现31种内生真菌，其中担子菌门包含8种，子囊菌门包含23种。

图2 担子菌门内生真菌进化树

表3 真菌序列与GenBank数据库中克隆序列比对的结果

续表3 真菌序列与GenBank数据库中克隆序列比对的结果

续表3 真菌序列与GenBank数据库中克隆序列比对的结果

3 讨论与结论

3.1 地衣型真菌多样性

地衣中的共生菌多为子囊菌，少数为担子菌，主要负责吸收水分和无机盐；提供光合作用的共生体多为蓝藻或绿藻，负责制造营养物质[13-17]。本研究根据序列测序结果共得到地衣型真菌 26种，其中25种地衣型真菌为子囊菌门，隶属8科13属，分别为点衣属（Ocellularia）、茶渍衣属（lecanora）、文字衣属（Graphis）、树花属(Ramalina)、大叶梅属(Parmotrema)、凸唇衣属(Platygramme)、Thelotremateae、絮缘衣属（Byssoloma）、Absconditella、Austroparmelina、类小核衣属（Pyrenula）、Chaenothecopsis、Graphidoideae。文字衣科(Graphidaceae)的地衣占50%，其中担子菌门只有一种，为云片衣属。说明在铜鼓岭热带季雨矮林内，子囊菌门的地衣在地衣种类中占绝对优势，且文字衣科的地衣最多。

3.2 地衣内生真菌多样性

地衣内生真菌与植物内生真菌相似，不仅不引起宿主表现病症，在分类学、多样性和进化历史等方面也都有一定的相似性[18]。李铭[19]研究中国云南丽江老君山地区的地衣内生真菌多样性时，对68株具有代表性的真菌菌株进行分子生物学鉴定，结果发现，该地区的内生真菌全部属于子囊菌门，分属于座囊菌纲、散囊菌纲、垂舌菌纲、茶渍纲、粪壳菌，共5纲17目，多样性程度较高，并指出不同地衣类型是地衣内生真菌多样性的主导因素。

本研究根据结果将所调查的地衣内生真菌分为31种，可以划分担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)两个大类，其中担子菌门包含8种，分属于柄锈菌纲(Pucciniomycetes)、担子菌纲(Heterobasidiomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)，共 4纲 5目；子囊菌门包含 23种，分属于子囊菌纲（Ascomycetes）、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、核菌纲(Pyrenomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、圆盘菌纲(Orbiliomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)，共6纲10目。表明在地衣体内除去构成地衣的地衣型真菌，地衣内生真菌也是种类和资源丰富的物种，此类真菌可能会对地衣自身的生长产生一定的影响，有待深入系统地开展研究。

图3 子囊菌门内生真菌进化树

目前，关于海南地衣的研究报道还相对较少，本研究尝试对铜鼓岭热带季雨矮林内的地衣进行调查，利用当前流行的分子测序技术，鉴定地衣及其内生真菌的种类。虽然本实验样地内的地衣型真菌和地衣内生菌群落显示出了一定的生物多样性，但与 GenBank数据库进行同源性比对发现，多数地衣型真菌和地衣内生菌为未知群落，导致无法明确大部分地衣型和地衣内生菌的分类，然而这一结果也暗示，该区地衣型真菌和地衣内生菌可能具有其独特的新类群。因此，对该区生态系统中的地衣开展研究具有重大价值和意义。