A型肉毒素对肌腱成纤维细胞增殖和TGF-β1、bFGF、MMP-2表达水平的影响

王 楠，许 良，吴国明

(杭州市萧山区中医院 骨科，浙江 杭州 311201)

在常规手术修复肌腱损伤的肌腱愈合过程中，受外源性愈合、炎性反应及肌腱细胞自身增殖的影响，常发生肌腱粘连，影响关节功能的恢复及患者预后。近年来，针对不同粘连发生的病理机制，布洛芬、6-磷酸果糖、5-氟尿嘧啶等药物被先后证明具有不同程度的防治肌腱粘连的作用，但目前临床应用较为局限，尚未找到肌腱粘连的有效解决办法。A型肉毒素(botulinum toxin type A, BTXA)是最早应用于美容整形外科的具有神经毒理作用的生物制剂，现阶段广泛应用于除皱、瘦脸等美容产业中，此外有研究表明BTXA能够通过抑制成纤维细胞增殖、减少胶原合成发挥抑制瘢痕增生的作用。本研究通过体外诱导培养兔肌腱成纤维细胞，观察相关细胞因子表达变化，旨在探究BTXA对肌腱粘连的作用及机制，为扩大BTXA治疗范围和临床防治术后肌腱粘连提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料 注射用A型100单位肉毒素购自兰州生物制品研究所有限公司(国药准字S10970037)；I型胶原酶(Worthington, Lakewood, NJ)；DMEM培养基、胎牛血清购自Invitrogen(Rockville, MD, USA)；Actin-tracker Green、DAPI荧光染料购自CST(Danvers, MA, USA)；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Aladdin公司；转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、牛碱性成纤维细胞生长因子(bovine basic fibroblast growth factor，bFGF)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2) 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；细胞周期检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 兔肌腱成纤维细胞提取及培养

1.2.1 实验动物 普通级成年雌性新西兰兔5只，体质量(3.5±0.5)kg，由浙江中医药大学实验动物中心提供(SYXK(浙)2019-0026)，动物实验操作严格遵守动物伦理保护法等相关规定，由我院伦理道德委员会监督开展。

1.2.2 细胞提取及培养 8 mg/100 g浓度氯胺酮肌肉注射麻醉动物，无菌切取前肢中跖趾深屈肌腱10条，参照文献报道方法采用组织块法进行原代培养，常规传代培养，细胞稳定传代3代后用于后续实验操作。

1.3 细胞检测

1.3.1 细胞增殖检测 将上述稳定传代的细胞分为对照组(Ctrl组)、低剂量组、中剂量组及高剂量组，分别给予0、10、30、50 U/mL BTXA。接种各组细胞1×10个于96孔板中，每组设置6个平行对照孔，常规培养至细胞贴壁后更换含对应浓度BTXA的DMEM培养基200 μL，对照组给予等量空培。继续培养12 h、24 h、36 h、48 h后向孔内加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，静置孵育4 h。弃上清液，加入200 μL DMSO溶解震荡细胞结晶产物15 min，酶标仪检测各组细胞在490 nm处的吸光值(OD 值)。

1.3.2 细胞周期检测 分组接种细胞于6孔板中，加入对应浓度BTXA的DMEM培养基1 mL，对照组给予等量空培，置于培养箱中诱导干预48 h。消化收集上述处理后的细胞，加入70%乙醇重悬细胞4 ℃固定过夜，离心收集细胞沉淀，参照细胞周期检测试剂盒染色处理后采用流式细胞仪检测各组细胞周期分布变化。

1.4 细胞免疫荧光观察 分组接种细胞于激光共聚焦培养皿中，每孔100个细胞，待细胞贴壁后给予不同浓度BTXA干预48 h，吸去培养基，4%多聚甲醛固定细胞30 min。去固定液，加入0.1% Triton-X室温处理10 min，5% BSA封闭30 min后加入Actin-tracker Green细胞骨架抗体(工作浓度1∶100)，避光孵育2 h。PBS洗涤培养皿2次，DAPI避光核染5 min后采用激光共聚焦显微镜观察并采集照片。

1.5 检测TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白及mRNA表达 各组细胞给药处理48 h后，ELISA检测各组细胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表达量，严格按照试剂盒说明书操作。收集给药处理后的各组细胞，qRT-PCR检测 TGF-β1、bFGF、MMP-2 mRNA相对表达量。引物序列：GAPDH，上游：CAATTGGCTCGAATACAGCA，下游：AGGACATGACGCATGGTCT；TGF-1，上游：CCTTAACAGGATGTGACC，下游：GGCTGCCCAGAGTTCGTAA；bFGF，上游：GCCGCCTCATCGGACGAC，下游：CCTTCTCAAGGTCG ACGGT；MMP-2，上游：TTCTGGGACCTGACCGACC，下游：AGGTCTGCTGAATCCGTCC。

1.6 统计学方法 上述实验结果均采用Graph Pad Prism 5进行数据处理，经正态分析和方差齐性检验后行方差分析，以<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BTXA抑制兔肌腱成纤维细胞体外增殖 经BTXA处理的各组细胞培养48 h后，细胞增殖活力均显著低于对照组，差异有统计学意义(=95.573，<0.05)。如图1所示：BTXA处理24 h后，高剂量组(50 U/mL)细胞体外增殖活力显著低于其他3组；BTXA处理36 h后，中剂量组(30 U/mL)细胞增殖活力显著低于对照组和低剂量组，差异均有统计学意义(<0.05)。

注: a与Ctrl 组比较，b与10 U/mL组比较，c与30 U/mL组比较，均P<0.05。图1 各组细胞生长曲线Figure 1 Cell growth curves of each group

2.2 BTXA调节兔肌腱成纤维细胞周期分布 给予0、10、30、50 U/mL BTXA干预诱导后，细胞周期分布阻滞在G0/G1期的细胞比例分别为(38.74±4.21)%、(43.13±6.36)%、(48.37±7.58)%、(61.03±7.63)%，S期停留细胞比例分别为(18.27±3.14)%、(15.23±2.84)%、(11.37±2.51)%、(8.14±1.92)%；高剂量组G0/G1期细胞所占比例较其他三组显著升高，S期细胞数量显著降低，差异均有统计学意义(<0.05)。中、高剂量组细胞G2/M期细胞含量较对照组和低剂量组降低，差异有统计学意义(<0.05)，而两组细胞间差异无统计学意义(>0.05)。见图2。

注: a与Ctrl 组比较，b与10 U/mL组比较，c与30 U/mL组比较，均P<0.05。图2 不同浓度BTXA对细胞周期进程的影响Figure 2 Effects of different concentrations of BTXA on cell cycle progression

2.3 BTXA影响细胞骨架形态及黏附变化 如图3所示：DAPI核染色呈蓝色荧光，Actin-tracker Green结合细胞骨架蛋白呈亮绿色荧光，与对照组相比，BTXA处理后各组细胞形态均发生明显变化，Actin-tracker Green阳性蛋白分布随BTXA干预浓度增加而减少。对照组细胞黏附较密集，细胞骨架呈一致性排列铺开；低、中、高剂量组细胞随BTXA剂量增加细胞黏附面积逐渐减小并出现皱缩，绿色荧光形态变化、染色面积较对照组逐渐减弱。

图3 不同浓度BTXA对细胞骨架形态影响(×1 000)Figure 3 Effects of different concentrations of BTXA on cytoskeleton morphology (×1 000)

2.4 细胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表达变化 与对照组相比，中、高剂量组细胞TGF-β1、bFGF蛋白表达水平显著降低，且高剂量组细胞TGF-β1表达水平显著低于其他3组，差异均有统计学意义(<0.05)；随BTXA干预浓度增加各组细胞MMP-2表达水平逐渐升高，中、高剂量组细胞MMP-2含量高于对照组和低剂量组，差异有统计学意义(<0.05)。见表1。

表1 不同浓度BTXA对细胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表达影响(n=6)

2.5 TGF-β1、bFGF、MMP-2 mRNA表达变化 如图4所示：与对照组相比，中、高剂量组细胞TGF-β1、bFGF mRNA相对表达量显著降低，且高剂量组细胞TGF-β1 mRNA表达水平显著低于其他3组；各组细胞MMP-2 mRNA表达水平随BTXA浓度增加而升高，高剂量组显著高于其他3组；差异均有统计学意义(<0.05)。

注: a与Ctrl 组比较，b与10 U/mL组比较，c与30 U/mL组比较，均P<0.05。图4 不同浓度BTXA对细胞内相关基因表达的影响Figure 4 Effects of different concentrations of BTXA on intracellular expression of related genes

3 讨论

目前研究认为肌腱粘连与肌腱愈合有着重要的联系，肌腱成纤维细胞既是外源性肌腱愈合的重要组成部分，也是一类重要的炎症细胞。术后损伤处炎性反应导致的局部组织液渗出会进一步加重肌腱粘连，因此抑制腱鞘中成纤维细胞的增殖是目前防治伤后肌腱粘连的重要研究方向。根据抗原性的不同，肉毒素中BTXA亚型近年来在降低手术后局部张力、抑制伤口瘢痕增生中得到广泛应用，提示BTXA可以在肌腱成纤维细胞中发挥类似作用。

本研究中，细胞免疫荧光结果显示BTXA作用于兔肌腱成纤维细胞后其细胞骨架牵张力显著减少，细胞粘连和爬片减弱，说明BTXA对肌腱成纤维细胞粘连和细胞张力具有明显抑制作用。MTT和细胞周期两组实验结果表明，中、高剂量BTXA能够显著抑制兔肌腱成纤维细胞体外增殖活性和细胞周期进程，提示BTXA能够显著抑制细胞周期进程从而抑制肌腱成纤维细胞活性。TGF-β1在成纤维细胞相关的肌腱重塑和细胞因子分泌过程中发挥调节细胞增殖、促进细胞间质分化的多重作用，本研究中给予高浓度TBXA刺激肌腱成纤维细胞可显著抑制细胞内TGF-β1 mRNA及蛋白质的表达水平。提示BTXA能够通过下调肌腱成纤维细胞中TGF-β1表达抑制细胞周期进程。

进一步检测细胞内MMP-2表达水平变化，结果显示BTXA能够提高细胞内MMP-2 mRNA及蛋白质的表达水平。结果提示BTXA对TGF-β1表达的抑制能够削弱TGF-β1介导的MMP-2表达降低，MMP-2加速降解胶原沉积调控成纤维细胞外基质的动态平衡，为肌腱损伤修复、避免细胞粘连和促进组织重塑提供了有力保障。近年来bFGF在肌腱损伤修复中的作用受到广泛关注，外源给予游离的bFGF能够促进胶原蛋白的分泌、加速胶原纤维重构从而改善肌腱结构，但持续的bFGF刺激反之会加重肌腱粘连，因此有效地控制bFGF的表达及分泌对肌腱愈合和避免细胞粘连具有重要意义。本研究结果表明中、高剂量BTXA能够有效抑制细胞内bFGF mRNA和蛋白质的表达水平，BTXA可以通过干预bFGF表达抑制成纤维细胞过度增殖及胶原蛋白的过度沉积发挥维持细胞外基质稳定、促进肌腱重塑的作用。

综上所述，BTXA可能通过抑制肌腱成纤维细胞增殖有效防治肌腱粘连，且作用效果具有一定的剂量依赖性，其作用机制可能与抑制TGF-β1和bFGF表达、促进MMP-2分泌、抑制细胞增殖活性等相关。本研究虽未直接探讨BTXA与肌腱成纤维细胞胶原表达的相关性，但推测BTXA可分别通过介导TGF-β1和bFGF表达下调抑制胶原分泌及沉积，为后期进一步开展体内实验研究奠定了理论基础。同时，体内bFGF以结合形式主要存在于细胞基膜上，这种内源性bFGF的表达调控是否同样受到BTXA的影响也值得更加深入地探讨。