面两亲性分子改造的铂类脂质体的分泌性磷脂酶A2响应性和体外抗肿瘤活性

刘燕娇，文 成，李 丹，高 佩，朱国东

（五邑大学生物科技与大健康学院，江门 529030）

铂类化疗药是临床上广泛使用的药物，具有较高的抗肿瘤活性，但因其非靶向体内分布以及无选择性进而杀伤正常细胞造成严重的不良反应，从而限制了其临床应用［1］。脂质体作为铂类化疗药的运输载体，可以提高药物靶向性，减少药物不良反应，但是如果载药脂质体到达肿瘤部位后不能有效地释放药物，会影响治疗效果［2］。比较典型的例子是SPI-077 脂质体，在临床Ⅱ期研究中治疗头颈癌、晚期非小细胞肺癌以及复发的卵巢癌，结果发现，SPI-077 虽然在肿瘤部位靶向积累，但由于极其缓慢的药物释放，其抗肿瘤效果远低于游离顺铂化疗药［3］。因此，开发具有可控释放药物性能的铂类脂质体对于肿瘤治疗至关重要。

分泌性磷脂酶A2（secretory phospholipase A2，sPLA2）在大部分肿瘤类型中高表达，包括前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和结直肠癌等［4-7］。研究人员以这种酶作为触发脂质体释放药物的刺激物，研究酶响应性脂质体以提高载药脂质体在靶点部位的药物释放能力［8-11］。sPLA2是一种酯酶，倾向于水解脂质体中磷脂的sn-2 位酯键，破坏磷脂膜释放药物，且水解产物为1 分子溶血磷脂和1 分子脂肪酸可作为膜渗透增强剂进一步触发药物释放［11］。因为sPLA2对水解底物有选择性，所以脂质体对sPLA2的响应性与脂质体组成成分有关，研究表明该酶更倾向于水解破坏由带负电荷的磷脂形成的脂质体，比如带磷脂酰乙醇胺（PE）或磷脂酰甘油（PG）等磷脂头的脂质［9-10］，但是较高含量的阴离子磷脂形成的脂质体会激活补体反应使载药脂质体的体内不良反应增加。目前进入临床研究阶段的酶敏感脂质体LiPlaCis，脂质体配方中通过加入物质的量分数为25%阴离子磷脂二棕榈酰磷脂酰甘油（distearoyl phosphoglycerol，DSPG）以确保脂质体对sPLA2的响应性，但是，动物实验和临床Ⅰ期安全性评价实验表明，引入过高的PG 阴离子磷脂会激活补体反应，造成严重的肝毒性和输液反应等副作用［10，12］，因此，需要寻找能提高酶刺激响应性的其他两亲性分子用于构建酶响应性脂质体，使酶响应性脂质体能在靶点部位可控释放药物的同时也具有较高的生物相容性。

石胆酸是胆酸类化合物，是人体内胆固醇代谢的次级胆酸，其疏水甾核结构和甲基基团形成疏水凸面，其羟基和羧基形成亲水凹面，是一个面两亲性分子，可自身相互作用形成胶束，也可与磷脂、胆固醇等形成混合胶束，用于运输药物，相比于不含石胆酸改造的脂质体，加入石胆酸改造脂质体的优势在于石胆酸能提高脂溶性药物溶解性，并且可作为膜渗透性增强剂，促进药物透过生物障碍，包括皮肤、血脑屏障、肠壁、鼻黏膜和角膜［13］。另外，De Luca 等［14］研究表明胆酸类分子（5 μmol/L）能显著提高sPLA2的活性（P=0.012）。将这类能提高sPLA2的活性和提高细胞膜渗透性的胆酸类分子与磷脂共制备成脂质体，其酶响应性如何目前还没有相关研究［8-11］。

本研究选择石胆酸（lithocholic acid，LCA）和3-酮石胆酸（3-keto lithocholic acid，kLCA）两种面两亲性胆酸类分子与磷脂制备成脂质体，LCA 相比于其他的胆酸类分子，其甾核含羟基个数最少（只有1个3α-OH），疏水性更强，不易造成包封药物的早期泄漏。本研究以二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2k（DSPE-PEG2k）两种磷脂为基础，加入LCA 或者kLCA 构建脂质体，研究其sPLA2酶刺激响应释放药物的特性和体外抗肿瘤效果。面两亲性分子LCA 或者kLCA 改造脂质体的制备流程及其响应sPLA2刺激触发药物释放的示意图见路线1。

Scheme 1 Schematic diagram of the preparation of facial amphiphiles-included liposomes(LCA-Lip),(n(DPPC):n(LCA):n(DSPE-PEG2k)=95∶10∶5); kLCA-Lip, (n(DPPC): n(kLCA): n(DSPE-PEG2k) = 95∶10∶5) and subjection to secretory phospholipase A2 (sPLA2) degradation for drug release.

1 材 料

1.1 药品与试剂

1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、1，2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-［甲氧基（聚乙二醇）-2000］（distearoyl phosphoethanolamine-PEG2k，DSPE-PEG-2k）（美国Avanti Polar Lipids 公司）；石胆酸（Lithocholic Acid，LCA，英国Fluorochem 有限公司）；3-酮基-5β-胆烷-24-羧酸（3-keto lithocholic acid，kLCA）按文献方法合成［15］；磷酸标准液（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）；曲拉通X-100、5（6）-荧光素［5（6）-carboxyfluorescein，CF］（北京百灵威公司）；细胞膜绿色荧光探针（DiO，北京索莱宝科技有限公司）；奥沙利铂（oxaliplatin，L-OHP，上海阿拉丁生化科技股份公司）；细胞计数试剂盒（CCK-8，上海陶术生物科技有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，上海依科赛生物制品有限公司）；胰酶（0.25% trypsin-EDTA）、双抗（pen strep）、RPMI 1640 和DMEM 培养基（美国赛默飞公司）；蜂毒型分泌性磷脂酶（bee venom secretory phospholipase A2，Bv sPLA2）、sPLA2（human type IIA）试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）；实验用水为超纯水（电阻＞3 MΩ，美国密里博Milli-Q 纯水仪）；乙腈、甲醇和三氯甲烷为色谱级；其他溶剂为分析级，未经进一步处理直接使用。

1.2 仪 器

超高效液相色谱-三重四极杆液质联用仪（美国Sciex 公司）；高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；纳米粒度与Zeta 电位仪（美国麦奇克公司）；Gen5 多功能酶标仪（美国伯腾仪器公司）；CytoFLEX 流式细胞仪、高速冷冻离心机（美国贝克曼贝尔特公司）；中型挤压仪（美国Northern Lipids公司）。

1.3 细胞株

人结直肠癌HT-29细胞和人结直肠癌Colo205细胞购自广州赛库生物技术有限公司。

2 方 法

2.1 脂质体的制备

脂质体通过薄膜水化-冻融循环挤出法制备。首先按配方要求将定量的磷脂、LCA、kLCA 或DiO（质量分数，3%磷脂）先溶于三氯甲烷中，然后使用微量玻璃进样针将其转移到圆底烧瓶中，使用减压旋蒸仪除去有机溶剂三氯甲烷以形成均匀薄膜。痕量有机溶剂通过过夜真空干燥除去。加入所要包封物质的水溶液（100 mmol/L 荧光素CF 水溶液或9 g/L的奥沙利铂水溶液），在55 ℃中水化2 min，然后涡旋2 min，重复此步骤使薄膜全部水化成脂质体混悬液。混悬液在液氮冻结，然后在55 ℃下水浴溶解，重复此冻融循环6 次。使用中型挤压仪使混悬液挤压通过两层聚碳酸酯膜（100 nm）5 次以上，获得分散均一的单层囊泡脂质体。未包封的荧光素CF 或者DiO 通过G75凝胶柱分离除去，未包封的奥沙利铂通过透析法透析48 h除去，透析袋截留相对分子质量大小为7 kD。制备好的脂质体放在4 ℃下保存待用。

2.2 包封率和载药量分析

脂质体磷脂浓度通过Bartlett 无机磷酸盐分析法测定［16］。通过透析法分析载药脂质体包封率。采用高效液相色谱法测定奥沙利铂质量［17］。将待分析载药脂质体混悬液2 mL 加入透析袋（截留相对分子质量为7 kD），透析液为400 mL，24 h 透析完成时取出保留液20 μL（其间换透析液两次），加入10%曲拉通20 μL 破膜，并用超纯水定容到1 mL 后进样分析测定包裹的奥沙利铂质量。取透析液1 mL 进样分析测定未被包裹的奥沙利铂质量。包封率（entrapment efficiency，EE，%）= 包载的药物质量./（包载的药物质量+未被包载的药物质量）× 100；载药量（loading efficiency，LD，%）=包载的药物质量/脂质体载体的质量×100。

2.3 电位和粒径分布分析

载药脂质体的电位、粒径大小及分散度通过纳米粒度与Zeta 电位仪检测，检测时的磷脂浓度为2.5 mmol/L。

2.4 酶刺激响应性分析

脂质体对sPLA2酶刺激响应性通过考察包裹荧光素CF 脂质体的CF 释放特性进行分析。首先把包裹荧光素CF的脂质体和氯化钙加入玻璃试管中，用Tri-HCl 缓冲液稀释使磷脂和氯化钙的最终浓度分别为50 μmol/L 和1 mmol/L，实验组加入sPLA2酶（100 μg/L），对照组不加sPLA2酶，然后放置在27 ℃水浴中孵育，首先在0 h 取样品200 μL，通过酶标仪检测荧光强度F0，作为荧光背景强度，检测激发光波长为480 nm，发射光波长为510 nm，然后分别在不同时间点取样品200 μL检测荧光强度Ft，最后加入10%曲拉通X-100 10 μL 破膜后检测总的荧光强度Ftriton。荧光素CF 释放率=（Ft-F0）/（Ftriton-F0）×100%。

2.5 体外血液稳定性分析

为了预测载药脂质体在体内生理条件下的稳定性，使用10%，50%FBS体外模拟生理条件，使用透析法分析载药脂质体的药物泄漏率。首先使用0%，10%，50% FBS/HEPES 缓冲液（HEPES 缓冲液含5%葡萄糖和10 mmol/L，pH 7.4）稀释载药脂质体并定容到2 mL，最终使药物质量浓度统一为58 μg/mL，待分析液加入到透析袋（截留相对分子质量为7 kD）中，透析液为HEPES 缓冲液15 mL，放在37 ℃摇床上振荡，在24 h和48 h时，收集透析液1 mL进样测量载药脂质体泄漏的奥沙利铂峰面积Afree，另外取相同体积的脂质体，使用曲拉通破膜，定容到15 mL，取1 mL 进样分析载药脂质体总的奥沙利铂的峰面积Atol。采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定奥沙利铂峰面积。奥沙利铂脂质体药物泄漏率（%）=Afree/Atol×100。

液相色谱条件：反向色谱柱为Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；进样体积为5 μL；流动相为10%甲醇和90%水（含0.1%甲酸）；流速为0.5 mL/min；柱温为40 ℃。

质谱条件：离子源，ESI 源；扫描模式，正离子模式的多反应监控模式（MRM）；采集离子对，母离子Q1 mass/子离子Q3 mass（m/z）：397.90/96.0；离子化电压，5.5 kV；离子化温度，550 ℃；去族电压，60 V；碰撞电压，52 eV。

2.6 sPLA2酶的收集与定量

结肠癌Colo205细胞分泌的磷脂酶A2（secretory phospholipase A2from Colo205 cells culture conditioned medium，CCM sPLA2）来 源 于 体 外 培 养Colo205 细胞的上清液，通过超滤管浓缩上清液的CCM sPLA2到合适浓度。将3×106个Colo205细胞接种于T75 培养皿中，使用含有10%FBS，1%双抗的全培RPMI 1640培养基培养，置于37 ℃、5%CO2的条件下培养，24 h 贴壁后，弃掉旧培养基，使用PBS 缓冲液润洗1 次，然后加入不含FBS 和酚红的新鲜培养基继续孵育48 h，收集细胞上清液，18 瓶T75共收集上清液350 mL。使用高速离心机，转速为6 000 r/min离心10 min，除去死细胞和其他沉淀物，收集上清液。使用超滤管（截留相对分子质量为3 kD）浓缩上清液，转速为6 000 r/min，最终浓缩体积为2 mL。使用sPLA2（human type IIA）免疫检测试剂盒检测酶的质量浓度为（11.19±30）mg/L。CCM sPLA2放在-80 ℃保存待用。

2.7 体外细胞摄取分析

脂质体体外细胞摄取量通过流式细胞仪分析测定。制备4 g/L DiO 储备液，取DiO 4 mg 溶于氯仿1 mL 中，使用甲醇稀释成4 000，400，40，4 μg/L 4 个标准溶液浓度，通过酶标仪测定荧光强度，激发光波长和发射光波长分别为484 nm 和501 nm，以荧光强度为纵坐标，以DiO浓度为横坐标绘制标准曲线。线性方程和相关系数分别为y=0.736x+51.56，R2=0.998，表明DiO 荧光强度在4~4 000 μg/L 质量浓度范围间线性相关性好。制备待测样品溶液，取DiO 标记的脂质体100 μL，加入甲醇900 μL，在65 ℃下加热2 min，超声2 min 破膜，然后移取200 μL 加入96 孔板中，使用酶标仪测定DiO 荧光强度，然后通过标准曲线推出DiO 标记脂质体的DiO质量浓度。

Colo205细胞或者HT-29细胞以每孔2×105个的细胞密度接种于6 孔板中，24 h 细胞贴壁后，移弃旧培养液，加入使用无FBS 培养基稀释的DiO标记脂质体（3 μmol/L DiO）1 mL，孵育箱避光培养2 h 后，移弃培养药液，用冷的PBS 清洗两次，加入胰酶200 μL，消化并收集细胞，使用超速离心机在1 800 r/min 转速中离心5 min，然后用冷的PBS缓冲液600 μL 重悬，再次离心，离心完成后重悬，使用流式细胞仪分析细胞摄取脂质体情况。

2.8 抗肿瘤活性分析

采用CCK-8分析法考察药物抑制细胞增殖的能力。将Colo205 和HT-29 细胞接种于96 孔板上，细胞密度分别为每孔6×103个和5×103个，使用含有10%FBS，1%双抗的完全培养基培养，置于37 ℃、5% CO2条件下培养，24 h 贴壁后，移弃旧培养基，加入使用培养基两倍梯度稀释后的药液（游离奥沙利铂，载药脂质体，奥沙利铂浓度范围为0.43~110 μmol/L；空白脂质体，其最高磷脂浓度与载药脂质体的最高磷脂浓度相同），空白对照组加入新鲜培养基，培养72 h 后，加入CCK-8 10 μL，37 ℃避光孵育2 h后，通过酶标仪检测吸收度A，检测波长为450 nm。细胞存活率（%）=Atest/Ablank×100。

2.9 数据分析

所有数据均检测3 次以上，以平均值±标准差（±s）表达。粒径分布数据用Origin v9.0 软件处理，稳定性、细胞内吞、抗肿瘤活性数据用GraphPad Prism v8.0 软件处理。采用GraphPad Prism v8.0 软件的非线性回归方法分析药物半数抑制浓度（IC50），采用GraphPad Prism v8.0 软件的双因素方差分析方法对荧光素CF 释放数据进行统计学分析，采用GraphPad Prism v8.0 软件的单因素方差分析方法对稳定性和细胞内吞数据进行统计学分析。

3 结果与讨论

3.1 脂质体配方的设计与理化性质表征

胆酸类分子与磷脂膜共存时，胆酸类分子浓度超过一定的阈值会破环磷脂膜结构。研究表明，胆酸类分子与磷脂的物质的量比例小于0.11的时候，胆酸类分子（如去氧胆酸和鹅去氧胆酸）会完全嵌入磷脂膜内；当其比例高于0.11时，胆酸类分子和磷脂会形成胶束［18］。因此，加入物质的量分数为9% LCA 或者9% kLCA 以制备脂质体LCA-Lip 或者kLCA-Lip。所制备脂质体的磷脂主要为两亲性磷脂DPPC，加入5% DSPE-PEG2k 磷脂以提高脂质体体内循环半衰期［19］。所制备载药脂质体粒径大小、多分散指数（polymer dispersity index，PDI）如图1和表1所示。制备的脂质体粒径分散均一（PDI ＜0.11），粒径大小约为100 nm。如表1 所示，LCA-Lip 和kLCA-Lip的电位大小与CLip 相似，均为-20 mV 左右，表明LCA 或者kLCA所带的羧基并没有影响脂质体表面电荷大小，可能是聚合物DSPE-PEG2k的加入，屏蔽了其羧基所带来的电荷干扰［20］。在奥沙利铂包封率及载药量方面，如表1 所示，LCA-Lip 和kLCA-Lip 与C-Lip 相比没有显著性差异（EE：LCA-LipvsC-Lip，P=0.89，kLCA-LipvsC-Lip，P= 0.71；LD：LCA-LipvsC-Lip，P= 0.34，kLCA-LipvsC-Lip，P= 0.94），而LCA-Lip 比kLCA-Lip 略高（EE：LCA-LipvskLCALip，P= 0.46；LD：LCA-LipvskLCA-Lip，P=0.50），P＜0.05 为具有显著性差异，结果表明，LCA的3-α 位羟基的改变可能会影响其构建的脂质体对药物的包载率，LCA 分子在磷脂膜中以3-α羟基之间的氢键相互作用形成二聚体，而kLCA的3-α 酮基脂溶性较高，兼容于磷脂膜可单独存在，不一定以二聚体形式相交，这种差别可能造成所构建磷脂膜性质的不同从而导致脂质体的药物包封率和载药量的差异。

Table 1 Characterization of liposomes in three formulations prepared by the thin-film hydration method(± s,n = 3)

Table 1 Characterization of liposomes in three formulations prepared by the thin-film hydration method(± s,n = 3)

PDI: Polymer dispersity index; LD: Loading efficiency; EE: Encapsulation efficiency

Group C-Lip LCA-Lip kLCA-Lip Size/nm 105±1 96±4 105±2 PDI 0.11±0.02 0.09±0.00 0.10±0.01 Zeta potential/mV-20.4±0.3-19.6±0.3-19.6±0.1 LD/%2.1±0.2 1.8±0.2 2.1±0.3 EE/%4.3±0.3 4.7±1.7 3.6±0.6

3.2 酶刺激响应性分析

荧光素CF 释放实验可以用来推断包裹亲水性药物脂质体在刺激物作用下的释放特性［9］。荧光素CF 包封在脂质体水性内腔时会发生高浓度荧光自淬灭现象（50 ~ 100 mmol/L），当荧光素CF被释放出来后，恢复去淬灭状态，其荧光强度可以被酶标仪检测［21］。在哺乳动物中，sPLA2有11种被表征出来的亚型（IB，IIA，IIC，IID，IIE，IIF，III，V，X，XIIA，XIIB），不同亚型的分泌型磷脂酶存在于不同组织部位和细胞部位，在不同生理病理部位中扮演着不同的角色，有其独特的酶功能［22］。蜂毒型（bee venom，Bv）sPLA2类似于人源性sPLA2-III，有相似结构，且经济易得，常用来代替人源性sPLA2-III用于研究酶功能［9，23-24］，但Bv sPLA2和人源性sPLA2-III 具有不同的底物亲和性，sPLA2-III 对PG 磷脂有强亲和力而Bv sPLA2没有这种选择性［25］。Colo205细胞分泌的sPLA2含有多种磷脂酶亚型，主要的磷脂酶亚型为sPLA2-IIA［10，26］。sPLA2-III和sPLA2-IIA在不同的肿瘤细胞中超表达［4-7，23，27］，所以本研究选用Bv sPLA2和CCM sPLA2两种不同来源的酶研究脂质体的酶响应释放药物特性。如图2-A 所示，在Bv sPLA2作用的48 h 范围内，LCA-Lip 和kLCA-Lip荧光释放率和C-Lip 相比，LCA 并没有明显提高脂质体的响应性，而kLCA 实际上降低了脂质体的酶响应性。如图2-B 所示，在CCM sPLA2作用的31 h范围内，包含LCA 及kLCA的脂质体的释放效能远优于普通脂质体，特别在24 h 时LCA-Lip 和kLCALip的荧光素CF 释放率为70%左右，而C-Lip 仅释放了20%荧光素CF。此外从图中可以看出kLCA的出现可以缩短酶作用延滞时间，孵育作用2 h 后明显提高荧光素释放率，而C-Lip 和LCA-Lip 需要较长的作用时间才能获得较高的释放率。以上实验结果表明，对于不同亚型的sPLA2，LCA 和kLCA可以提高或降低脂质体的响应性。Bv sPLA2虽然类似于人源性sPLA2-III，但其底物选择性并不尽相同，Bv sPLA2的响应性荧光素CF 释放分析结果可能不能代表人源性sPLA2-III的酶响应性荧光素CF释放特性，因此基于CCM sPLA2作用下的荧光素CF 释放特性，表明LCA-Lip 和kLCA-Lip 酶响应性优于C-Lip。

3.3 体外血液稳定性

纳米药物载体在体内血液循环中应避免早期药物泄漏，使更多包载药物到达肿瘤部位，减少药物不良反应和提高药物疗效。通过静脉给药的载药脂质体，血循环系统中的磷脂酶、高密度脂蛋白以及调理素会破坏脂质体的基本结构，造成脂质体药物泄漏或者被网状巨噬系统清除［28］。本研究检测脂质体在0%，10%或50%FBS/HEPES 缓冲液条件下孵育的药物泄漏率以初步评估其在体内的血液循环稳定性。实验结果如图3所示，加入10%或者50%FBS孵育24 h或者48 h，载药脂质体的药物泄露率并没有显著性地提高，在24 h 或者48 h时均没显著性差异，结果表明，FBS 对C-Lip，LCALip以及kLCA-Lip均影响不大，不会造成载药脂质体的药物快速泄漏，kLCA-Lip 在10% FBS/HEPES缓冲液条件下释放率比在50%FBS/HEPES 缓冲液高，但没有显著性差异，可能是FBS 中的蛋白与kLCA-Lip 之间复杂的相互作用造成［29］。另外，如图3 所示在相同孵育条件下，加入面两亲性分子LCA 或者kLCA 改造的脂质体的药物泄漏率与CLip 脂质体相比，虽没有显著性差异，但药物泄漏率均比C-Lip 脂质体高，这可能是LCA 或者kLCA在一定程度上造成磷脂膜的缺陷从而加速脂质体内部药物的释放，与前人研究一致［30-32］。

Figure 2 Release rate of 6-CF from liposomal formulations C-Lip, LCA-Lip or kLCA-Lip induced by (A) sPLA2 from bee venom (Bv sPLA2) or (B)sPLA2 from Colo205 cells culture conditioned medium (CCM sPLA2) at 27 °C; Inset figures describe the release pattern of the mentioned systems in the absence of sPLA2 at 27°C(± s,n = 3)*P ＜0.05, **P ＜0.01, ***P ＜0.001, ****P ＜0.000 1 vs group of C-Lip+sPLA2 and determined by Two-Way ANOVA.ns:Not significant

Figure 3 Leakage of oxaliplatin (L-OHP) from C-Lip, LCA-Lip and kLCA-Lip which were incubated in HEPES buffer including 0%, 10%, or 50%FBS for 24 h(A)and 48 h(B)at 37°C(± s,n = 3)

3.4 体外细胞摄取实验

为了考察LCA 或者kLCA 是否对脂质体的细胞内吞程度造成影响，本研究使用流式细胞仪分析Colo205细胞和HT-29细胞对DiO 标记脂质体的摄取量。如图4 所示，对于HT-29 和Colo205 细胞，DiO 标记的C-Lip，LCA-Lip 和kLCA-Lip 均可以被细胞内吞，相比于不含两亲性分子的C-Lip，加入LCA 或者kLCA的脂质体的内吞程度显著性降低，且面两亲性分子抑制Colo205 细胞内吞脂质体的程度比HT-29细胞的强。结果表明，相比于C-Lip，加入面两亲分子LCA 或者kLCA 改造的脂质体会减弱脂质体细胞内吞程度，且对不同类型的细胞抑制内吞的程度也不一样。

Figure 4 Flow cytometric histograms illustrating fluorescence from (A) HT-29 cells or (B) Colo205 cells incubated with DiO-labelled liposomes;Quantitative analysis of cellular uptake efficiency of DiO-labelled liposomes by (C)HT-29 cells or(D)Colo205 cells.Cells were treated with different DiO-labelled liposomes(3 μmol/L DiO)for 2 h.The flow cytometric analysis was performed in triplicate(± s,n = 3)*P ＜0.05, **P ＜0.01, ***P ＜0.001, ****P ＜0.000 1;ns represents not significant and data were analyzed by One-Way ANOVA

3.5 体外抗肿瘤活性

Pourhassan 等［10］研 究 表 明，Colo205 细 胞 上清液中的sPLA2-IIA 酶质量浓度为（185.43 ±92.46）μg/L，HT-29 细胞上清液中的sPLA2-IIA 酶浓度为（0.01 ± 0.01）μg/L，因此本研究选择分泌sPLA2的Colo205 细胞和不分泌sPLA2的HT-29 细胞作为实验对象，研究载药面两亲性分子LCA 或者kLCA 改造脂质体对高表达sPLA2肿瘤细胞的增殖抑制能力是否更强。采用CCK-8 法分析载药脂质体抑制癌细胞增殖能力。阳性对照组为游离奥沙利铂和载药C-Lip，实验组为载药LCA-Lip 和载药kLCA-Lip。如图5 所示，游离奥沙利铂的IC50小于大部分载药脂质体配方，归根于游离奥沙利铂不用经过药物释放这个过程，直接抑制肿瘤细胞增殖。如图5-A 所示，载药LCA-Lip 和载药kLCALip 抑制高表达sPLA2的Colo205 细胞增殖的能力强于载药C-Lip，与游离奥沙利铂的细胞毒性相似。如图5-B 所示，载药LCA-Lip 和载药kLCA-Lip 抑制不表达sPLA2的HT-29 细胞增殖的能力与载药CLip 相似，且其IC50明显大于游离奥沙利铂，是游离奥沙利铂IC50的2.6 ~ 2.9 倍。实验结果表明，载药LCA-Lip 和载药kLCA-Lip 相比于载药C-Lip，其抑制分泌sPLA2的Colo205 细胞增殖能力更强，抑制不分泌sPLA2的HT-29 细胞增殖能力相近，结合前面的荧光释放及细胞内吞实验结果，LCA-Lip 和kLCA-Lip 相比于C-Lip，酶响应度更高而细胞内吞程度较低，这些结果表明，在Colo205 细胞分泌的sPLA2酶作用下，能比C-Lip 释放更多的药物，从而提高其细胞毒性。

为了确定在载药脂质体杀死癌细胞过程中脂质体载体本身对癌细胞的杀伤性大小，本研究进一步分析了空白脂质体的细胞毒性。如图5-C 所示，奥沙利铂C-Lip 抑制50% Colo205 细胞增殖的磷脂浓度为534 μmol/L，相对应磷脂浓度的空白脂质体的Colo205 细胞增殖率为58%（黑色箭头指向处），说明奥沙利铂C-Lip 可通过脂质体载体本身的毒性来抑制Colo205 细胞增殖，结合内吞实验结果，空白C-Lip 抑制细胞存活可能是通过内吞作用造成细胞发生应激反应引起细胞凋亡［33-34］，也可能是sPLA2的水解产物溶血磷脂和脂肪酸提高细胞渗透性导致细胞膜裂解或者引起细胞凋亡程序从而杀死细胞［35］。奥沙利铂LCA-Lip和奥沙利铂kLCA-Lip 抑制50% Colo205 细胞增殖的磷脂浓度分别为173 和257 μmol/L，相对应磷脂浓度的空白LCA-Lip 和空白kLCA-Lip 对Colo205 细胞增殖率分别为88%和82%（黑色箭头指向处），说明载体本身对细胞毒性较小，也进一步表明载药LCA-Lip和载药kLCA-Lip 在有效药物浓度下，其载体生物相容性高，毒性较小。如图5-D 所示，奥沙利铂CLip 抑制50% HT-29 细胞增殖的磷脂浓度为376 μmol/L，相对应磷脂浓度的空白脂质体的HT-29细胞增殖率为56%（黑色箭头指向处），说明奥沙利铂C-Lip可通过脂质体载体本身的毒性杀伤HT-29细胞，这可能是细胞内吞引起的应激效应导致细胞死亡。类似于空白C-Lip，空白LCA-Lip 和空白kLCA-Lip 同样能抑制HT-29 细胞的存活，这可能是脂质体被内吞后，LCA 或kLCA 被释放出来杀死细胞。Katona 等［36］发现LCA 可以激活结肠癌细胞（HT-29，HCT-116）的caspase-2 和caspase-8，导致细胞凋亡或坏死。空白脂质体毒性实验表明，空白LCA-Lip 和空白kLCA-Lip 在较高浓度下有一定毒性，需要提高脂质体的药脂比，在安全的浓度范围内使用新型配方。

Figure 5 Cytotoxicity on free L-OHP,L-OHP-loaded liposomes and blank liposomes against sPLA2-secreting Colo205 cells and non sPLA2-secreting HT-29 cells.Free L-OHP and L-OHP-loaded liposomes were added to (A) Colo205 cells or (B) HT-29 cells; Blank liposomes were added to (C)Colo205 cells or (D) HT-29 cells.The lipid concentration of the blank liposome corresponding to the lipid concentration of L-OHP loaded liposomes at the value of IC50 were indicated by the arrows.Cells proliferation was determined by CCK-8 assay and the results represent as the percentage of untreated control group(± s,n = 3)

4 结 论

本研究使用面两亲性分子LCA 或者kLCA 构建sPLA2酶响应性脂质体（LCA-Lip，kLCA-Lip），实验结果表明，相比于普通脂质体C-Lip，LCA-Lip 和kLCA-Lip 脂质体对肿瘤细胞来源的sPLA2具有更佳酶刺激响应性，且在运载铂类药物奥沙利铂时，对高表达sPLA2的肿瘤细胞有更强的增殖抑制能力。本研究发现面两亲性分子LCA 或者kLCA 改造的脂质体具有一个新的功能特点，即对肿瘤部位超表达的sPLA2具有较高的响应性，补充并拓展了此类脂质体在抗肿瘤领域中的应用。