VISTA靶点肿瘤免疫治疗的研究进展

张 煜，严 方，肖易倍

（中国药科大学药学院，南京 211198）

肿瘤可以利用免疫逃逸机制来绕过免疫监视，包括诱导免疫抑制微环境和抑制肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中效应T 细胞的功能［1］。免疫检查点是预防自身免疫、保护宿主免受组织损伤和调节自身耐受的关键受体。在TME中，肿瘤细胞通过抑制性免疫检查点（ICIs），下调免疫细胞的活性，从而避免被杀伤的命运，实现免疫逃逸。对应的抗体可以逆转这一过程，恢复免疫细胞的杀伤力，从而杀伤甚至清除肿瘤细胞。

随着细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）的阻断抗体Ipilimumab 和程序性死亡蛋白-1（PD-1）的两种阻断抗体Pembrolizumab和Nivolumab在临床治疗中展示出显著的疗效［2］，免疫治疗成为肿瘤治疗的重要方式。然而，实体肿瘤患者对现有检查点抑制剂的总体应答率一般低于30%［3］，亟待寻找新的治疗靶点。VISTA 是新型的检查点分子，通过抑制T细胞活性，阻止有效的抗肿瘤反应。近年来有研究认为，VISTA是机体对免疫治疗产生耐药性的原因之一。Kakavand等［4］发现，大多数黑色素瘤患者在单独使用抗PD-1 抗体或联合使用Ipilimumab 治疗后，VISTA 阳性淋巴细胞的比例显著增加。前列腺癌患者用Ipilimumab 后也出现该现象，将VISTA 与经Ipilimumab 治疗的前列腺癌患者的外周血单个核细胞（PBMCs）共培养会导致干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）产生减少，加入其抗体后IFN-γ 分泌恢复［5］。因此VISTA 可能成为克服当前免疫检查点疗法耐药性的新靶点。本文综述了VISTA的结构、配体、生物学功能，总结了在研VISTA 抑制剂并介绍了抑制剂筛选方法。

1 VISTA结构与配体

1.1 VISTA发现

VISTA，又 称PD-1H、B7-H5、Dies1、Gi24、DD1α 和C10orf54，是由人的VSIR 基因编码（小鼠由Vsir基因编码）的Ⅰ型跨膜蛋白。2011年Noelle等［6］首次报道鼠的VISTA 蛋白能抑制其T 细胞的激活。2014 年该团队证明人的VISTA 同样对T 细胞具有负性调节作用，是新型的ICIs［7］。在正常生理条件下，VISTA 对维持T 细胞耐受至关重要。无外来抗原刺激时，表达在初始CD4+T细胞和γδT细胞上的VISTA 能抑制自身反应性，阻止T 细胞的激活［8］。

体外实验发现，在给予抗CD3 抗体刺激情况下，人源和鼠源的VISTA-免疫球蛋白融合蛋白（VISTA-Ig）抑制T 细胞的激活、增殖和细胞因子的产生［7］。因此，VISTA 激动剂可用于治疗自身免疫疾病，Flies 等［9］发现VISTA 激动性抗体能抑制T 细胞的激活，避免移植物免疫细胞对宿主细胞攻击，有效预防小鼠的急性移植物抗宿主病（acute graftversus-host disease，GVHD）。

1.2 VISTA结构

对人源VISTA 进行结构分析，蛋白全长含有279 个氨基酸，由单个N 末端免疫球蛋白V 样结构域（IgV）、茎状区域、跨膜区域和胞内端组成，与鼠源VISTA 氨基酸序列有77%相似性。人源VISTA蛋白全长具有CD28 超家族的成员PD-1、CD28 和CTLA-4 的特征，其中与PD-1 的相似性最高。其C末端含有3个酪氨酸激酶同源3结构域（Src homology domain 3，SH3）结合基序（PxxP）和一个酪氨酸激酶同源2结构域（Src homology domain 2，SH2）结合基序（YxxQ），可以作为受体，以类似于PD-1 的方式向表达VISTA的细胞发出信号［10］。在VISTA/PD-1双敲除小鼠模型中，T细胞对外源抗原的反应水平远大于任一单敲除小鼠，说明VISTA 通过异于PD-1的作用途径调节T细胞［11］。

与蛋白全长不同，Mehta 等［10］解析的VISTA 胞外结构域（VISTA extracellular Dodoma，VISTAECD）结构与B7家族具有很高的同源性，均含有保守的IgV 样折叠。其中与PD-L1 序列相似性较高。该结构特征表明VISTA 也可能起配体的作用。同时VISTA的特有结构特征，包括保守的C51/C113二硫键，富含组氨酸的分子表面互补决定区域，从结构域向外扩展的C-C′环等是其独特功能的基础（图1）。

图1 VISTA-ECD晶体结构(PDB:6U6V)VISTA-ECD 含有10 条β 链（A-H，A′和C′）和3 条α 螺旋，其中红色部分为长而迂回的C-C′环

1.3 VISTA配体

目前，研究人员报道了人源VISTA与两个潜在配体相互作用后均产生免疫抑制功能，分别为VSIG-3（V-set and Ig domain-containing 3）即免疫球蛋白超家族11（Ig superfamily member 11，IGSF-11）［12］和P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）［13］。VSIG3 是免疫球蛋白超家族的成员［14］，在多种非造血细胞上表达，介导非钙离子依赖性同源性黏附。PSGL-1是介导白细胞运输的黏附分子，在T细胞上表达时作为ICIs传导抑制信号［15］。在慢病毒感染的小鼠体内，其通过上调T细胞PD-1 的表达，抑制耗竭的CD8+T 细胞中T 细胞 受 体（T cell receptor，TCR）和 白 介 素-2（interleukin-2，IL-2）的信号传导发挥作用。

2017 年，通过对人源单跨膜蛋白库进行高通量筛选，Yang 等［16］发现VSIG3 与VISTA 在蛋白和细胞水平上具有相互作用。体外实验发现VSIG3通过VISTA抑制T细胞多种细胞因子的分泌，包括IL-2、IL-17、IFN-γ 等。2019 年Johnston 等［13］发现PSGL-1是VISTA 酸性条件下选择性配体。在小鼠肿瘤模型中，阻断VISTA-PSGL1 结合的抗体能够解除VISTA 依赖性免疫抑制。在TME 常见的pH 6.0条件下，VISTA对PSGL-1的表观结合亲和力为4 nmol/L，但在生理pH 条件下未检测到其与PSGL-1 的结合。而VSIG3 在生理pH 和偏酸性条件下均能检测到与VISTA的结合，但相对于中性pH，亲和力下降至80 nmol/L。直至目前，VSIG3 和PSGL-1与VISTA 在肿瘤免疫中的作用相关数据仍然匮乏，相关途径的体内作用方式亟待进一步研究。

2 VISTA 在TME 中的表达及其作为受体或配体的功能

肿瘤微环境在肿瘤发展、免疫逃逸和耐药中发挥重要作用。其构成复杂，由肿瘤细胞及其周围的基质细胞、血管内皮细胞、免疫细胞、相关分泌因子和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等组成［17］。在TME 中浸润的免疫细胞，除了发挥抑制肿瘤功能的CD4+辅助性T 细胞（helper T cell，Th）、CD8+细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）、M1 型巨噬细胞外，还有促进TME的产生免疫抑制的组分，如调节性T 细胞（regulatory T，Treg）、M2 型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）、髓系来源的抑制细胞（myeloidderived suppressor cells，MDSCs）等。VISTA在TME的多种细胞上均有表达（图2），这增加了研究其作用机制的难度。

图2 肿瘤微环境(TME)中VISTA的表达和相互作用[37]

2.1 淋巴细胞上的VISTA介导免疫抑制

在大多数人类癌症和小鼠模型中，VISTA主要在TME的免疫细胞上表达，且在髓系细胞中的表达高于淋巴细胞［18］。

在小鼠胸腺中，VISTA 在CD4+单阳性细胞上低表达，在CD8+单阳性细胞上表达水平较高，而在CD4+CD8+双阳性细胞上无表达。在脾脏和淋巴结等外周淋巴器官中，VISTA 在初始CD4+T 细胞和Treg 细胞上表达，而在CD4+记忆样T 细胞上表达较少［6］。作为ICI，VISTA 在初始T 细胞上表达，使得T细胞维持静息状态，影响肿瘤抗原反应的初级阶段。而CTLA-4 和PD-1 在活化的T 细胞上表达。CTLA-4 在启动阶段通过限制共刺激抑制T 细胞活化，进入无能状态。PD-1在启动后期表达，引发T 细胞耗竭［8］。在B 细胞表面则几乎检测不到VISTA的表达。

相关研究表明，VISTA蛋白在免疫抑制性肿瘤浸润性白细胞上的表达明显上调，如抑制性FoxP3+Tregs 和MDSCs［19］。在 多 种 人 类 肿 瘤 类 型中，VISTA的表达随着疾病进展而增加，表现更差的预后结果。例如在肾癌、CT26 结肠癌、B16 黑色素瘤和MB49 膀胱癌中，VISTA 在MDSCs 上的表达显著上调，促进其免疫抑制功能。作为MDSCs 上的受体，VISTA 通过促进TRAF6 蛋白降解，抑制Toll 样受体（TLR）介导的MAPK/AP-1 和IKK/NFkB 信号通路的激活［20］。在细胞水平上，VISTA 调节骨髓源性抑制细胞和耐受性树突状细胞（DC）亚群的效应功能。阻断VISTA 增强了它们产生促炎介质的能力，减少了对T 细胞的抑制功能，同时改善肿瘤微环境，促进T细胞浸润和激活［20］。小鼠模型中，敲除VISTA 后巨噬细胞表面CCR2 和CCR5调节异常，导致其配体CCL2 和CCL3 积累。趋化因子受体的循环的改变使得其向肿瘤微环境迁移的能力降低［21］。以上研究表明，使用抗VISTA 治疗药物来调节肿瘤微环境中的巨噬细胞或免疫抑制MDSCs是可行的治疗策略。

2.2 肿瘤细胞上VISTA的双向作用

虽然VISTA 通常在免疫细胞中更普遍，但一些研究也显示其在人的非小细胞肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌的肿瘤细胞或细胞系上均有表达。在小鼠肿瘤细胞系上的表达则十分罕见［22］。VISTA 在肿瘤细胞上表达的作用复杂且存在争议。直至目前，多数研究认为VISTA 抑制免疫系统。但有些试验现象表明，肿瘤上VISTA的表达伴随着生存率的提高。可能是因为VISTA 在有效免疫反应的炎性肿瘤微环境中上调，“热肿瘤”中富集有发挥抑瘤活性的活化T 细胞和髓系细胞，生存率相对较高［23］。

作为抑制性配体，Rosenbaum 等［24］观察到在在黑色素瘤中，VISTA 受到factor forkhead box D3（FOXD3）的调控，在肿瘤细胞中特异性表达，促进肿瘤发展。同时，FOXD3 增强肿瘤浸润巨噬细胞上PD-L1 表达，促进肿瘤内T 调节细胞的增加。Hong等［25］发现VISTA 在肾透明细胞癌中的表达较癌旁正常细胞明显上调，mRNA和蛋白水平均有较高的表达，且其表达水平可高于PD-L1 的表达水平，在此情况下T细胞的抑制可能由VISTA主导。

在卵巢癌等几种特定癌症类型中，VISTA在肿瘤细胞上的高表达与良好预后密切相关，表明VISTA也可能作为共刺激分子发挥作用，但机制尚不明确。在癌症基因组图谱（TCGA）的肿瘤类型中，人VISTA 在上皮样间皮瘤中表达最高。在该种肿瘤患者中，VISTA高表达与较好的临床预后相关，而PD-L1 与较差的预后相关［26］。在99%的非小 细 胞 肺 癌（human non-small cell lung cancer，NSCLC）中能检测到VISTA 蛋白的表达，其中肿瘤细胞表达率为21%［27］。VISTA 在人类非小细胞肺癌中的高表达水平，与肿瘤浸润淋巴细胞增多，PD-1/PD-L1 信号轴标志物，特异性基因组改变和预后有关。在肺腺癌中，VISTA 表达水平的升高与EGFR 缺失和较低的突变负荷相关［28］。非小细胞肺癌肿瘤间室中出现VISTA 预示5 年生存时间延长。此外，高VISTA/PSGL-1 共定位与非小细胞肺癌患者总生存率的提高有关［29］。在卵巢癌中，VISTA可在内皮细胞、肿瘤浸润细胞和肿瘤细胞中表达［30］。癌症细胞系百科全书基于深度RNA测序展 现（CCLE；http：//www.broadinstitute.org/ccle）VISTA 在52 种人类卵巢肿瘤细胞系和27 种子宫内膜癌中均有表达。VISTA 抑制抗体给药后，卵巢癌荷瘤小鼠的存活时间延长［31］。Liao 等［32］发现VISTA 能影响卵巢癌的进展，其表达随着晚期病程和淋巴结转移而增加。与免疫细胞相反，卵巢肿瘤细胞中的VISTA 表达与高度恶性浆液性卵巢癌患者的良好预后正相关［33］。

除在免疫细胞和肿瘤细胞外，卵巢癌［33］和胃癌［34］的内皮细胞上也可以检测到VISTA的表达。以上讨论表明VISTA 在不同肿瘤类型发挥不同的功效，可看出其对癌症免疫的影响十分复杂。由于VISTA的功能是组织特异性的，作为癌症免疫治疗中的靶点，仍需深入研究，辨明其在不同肿瘤TME中的表达情况和功能。

2.3 TME对VISTA表达和功能的影响

肿瘤微环境非常复杂，多种因素都可以影响VISTA的表达，目前对缺氧和酸性环境的研究较为透彻。TME 中增生的肿瘤细胞引起的耗氧量和扩散量的增加，氧输送减少，造成缺氧。在氧气含量处于低水平时缺氧诱导因子（HIF）脯氨酸羟化反应速率降低，进而影响其泛素化进程，HIF1的蛋白酶体降解被抑制，导致HIF1 蛋白水平升高。HIF介导多种途径影响代谢，其活化通常与预后差相关。另一方面氧气供给不足使得肿瘤细胞主要通过糖酵解供能。这使得代谢产物乳酸积累，影响TME 酸碱平衡。除此之外，肿瘤细胞为了避免自身酸中毒，通过胞膜上的质子转运蛋白排出H+也在造成了TME的pH 降低。多种因素结合造成TME整体呈现酸性。Deng等［35］发现在一组结直肠癌患者中VISTA 和缺氧诱导因子（HIF）-1α 活性相关。在后续的研究中，他们在CT26 结直肠癌小鼠模型中也观察到该现象。染色质免疫沉淀和基因沉默试验结果表明在低氧条件下，（HIF）-1α 与VISTA启动子中的一个保守的缺氧反应元件结合，上调髓系细胞上VISTA的表达。由于VISTA ECD富含组氨酸，在酸性pH 条件下，组氨酸侧链基团带正电，具有极性和亲水性。组氨酸富集区域形成pH 依赖性结合位点。Johnston 等［36］发现VISTA多聚体在pH 低于6.5 时结合白细胞，但在生理pH 7.4 时不能结合白细胞。TME的pH 可低至5.85，利于结合。转染VISTA的细胞在低pH 下更有效地抑制T 细胞，主要通过与PSGL-1 结合后激活新途径，放大免疫抑制作用［37］。

3 VISTA阻断抑制剂研究现状

作为免疫治疗的新靶点，VISTA抑制剂研发正受到越来越多的关注。部分小分子抑制剂和抗体已进入临床研究阶段（表1、图3）。

图3 化合物结构及其与抗体结合表位

表1 处于临床试验阶段的VSITA抑制剂

3.1 VISTA小分子抑制剂研究现状

2015 年10 月，Curis 与Aurigene 合作推出可选择性靶向PD-L1 和VISTA的口服小分子拮抗剂CA-170［38］。临床前体外数据表明，CA-170 可以诱导T 细胞增殖和促进IFN-γ 释放。此外在多种动物肿瘤模型中，CA-170 具有与抗PD-1 或抗VISTA抗体类似的抗肿瘤作用，并于2020 年完成了针对人体晚期实体瘤或淋巴瘤的Ⅰ期临床试验［39］，Ⅲ期临床试验也在进行中。但Musielak 等［40］和Gabr等［41］用常规的体外生化实验测得CA-170 与PD-L1以及VISTA之间没有直接结合，其功效有待证实。

Gabr 等［41］基于TR-FRET（time-resolved fluorescence resonance energy transfer）原理从化合物库中筛选出了与VISTA 有亲和力的先导化合物NSC622608。优化后的化合物Ⅲ能在体外阻断VISTA信号传导，解除高表达VISTA的卵巢癌和子宫内膜肿瘤细胞系对Jurkat T 细胞增殖的抑制，同时促进其与T 细胞共培养时IFN-γ 和TNF-α 的分泌。

3.2 VISTA抗体研究现状

JNJ-61610588（CI-8993/VSTB112）［42］、W0180［43］和HMBD-002［44］是目前进入临床试验的3种VISTA抑制性单克隆抗体。BMS-767（P1-068767）［45］和SG7［46］尚处于临床前研究阶段。

Janssen 公司于2016年启动了IgG1 kappa型抗体JNJ-61610588（NCT02671955）的临床研究，Ⅰa期试验招募了12 例患者，用于评估该抗体治疗晚期实体瘤的安全性、药代动力学和药效学。据报道，其中1位患者在治疗过程中出现细胞因子释放综合征，之后该研究被Janssen 公司终止。2020 年Curis 公司将其重新命名为CI-8993 并于9 月启动Ⅰ期研究（NCT04475523），评估CI8993 用于复发/难治性实体瘤患者的安全性、耐受性和抗肿瘤活性。癌症免疫治疗协会第36 届年会上公布了CI-8993 的最新临床前数据［47］：PET（正电子发射断层扫描）成像和定量验证了Zirconium-89（89Zr）记的CI-8993在体内与人源VISTA的特异性结合。该试验结果能协助CI-8993 药代动力学研究，确定其在患者中的生物分布。

Pierre Fabre 研发 的W0180 同 为IgG1 kappa 型抗体。临床试验中，除测试其单独抗肿瘤作用外，同时评估其与PD-1 抑制性单克隆抗体pembrolizumab联用是否能增强疗效。

Hummingbird Bioscience 正在开发的HMBD-002 靶向基于计算预测VISTA的功能表位。通过阻断VISTA的功能性C-C′环区域［48］，逆转VISTA诱导的免疫抑制效应。作为IgG4 亚型抗体，对大多数FcγR 受体具有较弱的亲和力，并且缺乏激活补体的能力，能在阻断VISTA 抑制功能的同时不消耗VISTA 阳性细胞。HMBD-002 对不同物种VISTA（人类、食蟹猴和啮齿动物）均有亲和力，且对VISTA 与VSIG3 相互作用显示强剂量依赖性抑制［44］。与CI-8993 相 比，HMBD-002 能有 效解 除MDSC 对T 细胞IFN-γ 分泌的抑制。在混合淋巴细胞反应分析中，炎性细胞因子、IFN-γ 和TNF-α 的水平显着增加，CD14+单核细胞增殖受到抑制。在小鼠植瘤模型中，HMBD-002 显著抑制肿瘤生长，提高小鼠存活率［49］。2022 年1 月启动的HMBD-002 的Ⅰ/Ⅱ期临床试验（NCT05082610）将评估其用于晚期实体瘤患者的疗效，其中包括三阴性乳腺癌（TNBC）、非小细胞癌肺癌（NSCLC）等其他癌症。同时测试其与pembrolizumab 联用的疗效。由于VISTA在TNBC和NSCLC中高表达，这两种癌症被确定为临床研究的优先适应证。

BMS-767 是其中唯一的pH 选择性封闭抗体［45］，特异性靶向低pH 肿瘤部位，且仅在pH 6.0时阻断VISTA 与PSGL-1或VSIG3的相互作用。该特异性将降低非肿瘤反应性和副作用。

斯坦福大学团队利用酵母表面展示技术设计出与小鼠、人和食蟹猴VISTA 蛋白均具有高亲和力的具有物种交叉反应性抗体SG7［46］。一方面，与HMBD-002 相比，其与鼠源和人源VISTA 蛋白亲和力水平相当，使得药物能够在野生型小鼠中进行更有效的临床前表征，简化进入临床试验流程。另一方面，SG7与其他单克隆抗体与Fc受体（FcR）的结合不同，BMS-767 和CI-8993 含有一个活性的Fc 片段，而SG7 则有一个“死亡”的Fc 区。在B16F10、MC38 和4T1 肿瘤模型中，含有活性FC的SG7表现出更多的髓系细胞耗竭，但在减缓肿瘤生长方面并不比含有“死亡”FC的形式更有效。据此，SG7 的毒性可能低于其他单抗。综上所述，SG7是一个具有前景的临床候选药物。

4 靶向VISTA的免疫检查点抑制剂筛选方法

前期针对PD-1/PD-L1 的抑制剂的研究为后续新型免疫检查点药物的开发提供了可靠的理论和实践基础。目前免疫检查点药物筛选普遍的流程包括3 个部分：（1）在体外通过生物物理和生物化学分析检测亲和力；（2）通过细胞水平试验评估阻断和生物活性作用；（3）构建异种移植动物模型证实其抗肿瘤作用［50］。由于每种ICIs 特性以及研究深度不同，实际研发过程中试验方法需要做出相应的调整。

4.1 结合亲和力检测

结合亲和力是衡量潜在抑制剂与免疫检查点蛋白结合能力的最关键参数之一，ELISA是最为广泛使用的检测方法［51］，但并不适合于高通量筛选，AlphaELISA［52］可用于替代ELISA，其基于发光氧通道化学原理，抗干扰能力强，动态范围宽且易于实现自动化。SPR（surface plasmon resonance）［53］和BLI（biolayer interferometry）［54］是两种常用的实时监测生物分子相互作用的无标记技术，通过光学信号的变化反映化合物的结合情况，可用于高通量筛选。ITC（isothermal titration calorimetry）［55］通过分析物和蛋白质结合时产生的热量变化判断相互作用强弱。MST（microscale thermophoresis）技术需要标记目的蛋白但无需偶联［56］。NMR技术检测范围广［57］，可以检测微弱的分子间相互作用。NMR 竞争性分析（weak-antagonist induced dissociation assay-NMR w-AIDA-NMR）和TR-FRET 则能进一步提供待检测分子能否对蛋白质-蛋白质相互作用产生阻断作用的相关信息［58］。

在VISTA 小分子抑制剂筛选中，研究者们采用了多种方法相互验证。例如，化合物Ⅲ优化过程中，Gabr 等［41］通过SPR 测试表观亲和力，同时也通过竞争性ELISA 检测化合物能否抑制VISTA 与VSIG-3 的相互作用。由于目前报道的VISTA的两个配体有待研究，Gabr 等［41］用VISTA 抑制性抗体代替配体构建TR-FRET 模型，测试抑制剂的阻断作用。但该方法存在明显缺陷，无法确保筛选出的拮抗剂能抑制VISTA 与其真实配体的结合。通过交叉验证能有效地避免假阳性结果。

4.2 基于细胞的功能分析

细胞水平分析主要包括基于生物发光报告细胞的分析［59］和以T 细胞为基础的生物功能评价［60］。虽然VISTA 具有作为受体、配体的双重特性，目前构建细胞水平的分析方法时普遍将其视为配体。

生物发光报告细胞试验需要构建两种细胞，表达ICIs的APC/CHO-K1 细胞系和效应细胞系。效应细胞系通常为含带有NFAT 反应元件的荧光素酶报告质粒的Jurkat T细胞［41］。

在共培养体系中，VISTA 与其T 细胞上受体结合，进而抑制NFAT反应元件介导的TCR信号和发光。VISTA 抑制剂的存在阻断了相互作用，导致TCR 信号和发光的重新激活，因此可以通过荧光信号强弱来筛选药物。

基于T细胞的检测包括效应细胞、呈现ICIs的细胞和效应细胞的激活信号（CD3 激活物）。为了提高准确性和重复性，实验中一般使用永生化细胞系而非原代细胞。例如效应细胞通常使用Jurkat 人T 细胞系，以检测CD3 依赖的T 细胞的激活。评价VISTA 小分子抑制剂的功能时，通常采用基于细胞共培养的方法或与VISTA 蛋白孵育的单细胞培养方法。其理论基础是加入靶向VISTA的小分子后，T 细胞功能障碍将得到改善。T 细胞功能检测包括T 细胞增殖、T 细胞相关细胞因子释放（IL-2 和IFN-γ）以及下游相关通路（包括蛋白活性及其磷酸化）的变化［61］。在体外活性试验中常用以上3种指标评价药物活性。

4.3 基于小鼠肿瘤模型的活性分析

常见的肿瘤模型包括肿瘤细胞系异种移植（cell-derived xenograft，CDX）小鼠模型［62］、人源肿瘤组织来源移植瘤（patientl derived xenograft，PDX）模型和免疫系统人源化小鼠模型［63］。其中CDX 最为常用。但由于肿瘤组织异质性的丧失，生物学特性与临床相似度降低，同时药效评价结果差异较大。在PDX 模型中，肿瘤以组织的形式直接移植使得肿瘤异质性得以保留，可用于耐药标记物和化疗药物敏感相关研究。但该模型因其荷瘤小鼠免疫缺陷而无法用于免疫相关药物的筛选，人源化小鼠模型能较好地模拟人体免疫特征。

在实际药物筛选时可通过多种模型测试其活性［48］，包括易于构建的CT26 结直肠癌CDX 小鼠模型、高表达VISTA的4T1 乳腺癌CDX 小鼠模型和人源化的Hu-HSC（humanized-hematopoietic stemcells）小鼠模型。后两种模型有效弥补单一CDX模型试验的缺陷，能测试药物对靶点的选择性以及疗效的种属特异性。

模型构建成功后，通过给药前后的肿瘤抑制率（tumor growth inhibition，TGI）、动物体重变化、TME 中具有活性的CD4+/CD8+免疫细胞、抑制性细胞数量变化以及细胞因子水平IFN-γ 评价抑瘤活性［48］。在进行药效筛选的同时，需对药物进行药代动力学和毒理学的相关研究，确保安全性的同时为后续研发收集数据以及提供思路。

5 总结与展望

ICIs 疗法是近年来肿瘤免疫治疗领域的研究热点，在临床上，多种类型的肿瘤患者对PD-1/PDL1 和CTLA-4 抗体治疗具有高应答率。但个体差异导致的无应答和耐药性限制其更广泛的应用。因此，研究人员致力于发现新型的ICIs 以期惠及更多患者。VISTA 作为近年新发现的ICIs 具有更大的发展潜力，其抑制性抗体在小鼠模型能有效抑制肿瘤生长，与PD-1/PD-L1 抗体联用效果更为显著。相关治疗性抗体和小分子药物临床试验相继开展。但由于VISTA ECD 表面平坦，小分子药物结合位点的设计具有挑战性，需要得到更多先导化合物与靶点结合的相关位点参数。对此，本课题组通过SPR 高通量筛选，获得了与VISTA 具有高亲和力的二唑类化合物。在基于T 细胞的功能分析中能达到与抗体接近的疗效，同时在CT26 结直肠癌CDX 小鼠模型中能有效抑制肿瘤的生长。后续试验将聚焦于通过解析该化合物与VISTA的晶体结构，分析关键结合位点，从而进行优化和改造。

然而，由于VISTA 富含组氨酸，具有配体受体双重角色以及在TME 中表达与相互作用关系复杂等特性，其抑制剂的筛选方法仍需优化。对两种配体VSIG3 和PSGL-1 在体内是否存在竞争作用，在不同细胞类型和环境中谁占主导，下游通路信号通路等机制的研究将有助于建立更具特异性和系统的筛选方法，提高药物研发的成功率。

综上所述，虽然VISTA 靶点研究有待深入，但其抑制活性的组织特异性以及与PSGL-1 结合的pH 依赖性使得VISTA 在现有的ICIs 中独具一格。其特性使得开发肿瘤部位富集的pH 选择性抑制剂成为可能，为未来的肿瘤免疫治疗开辟新的领域。