神经前体细胞表达发育性下调蛋白4在消化系统肿瘤发生中的作用

代俊泽， 金 燕， 金海峰

(1)延边大学医学院细胞生物学与医学遗传学教研室；2)延边大学附属医院内科教研室，吉林，延吉 133002)

癌症的发生、发展及预后与基因的改变和翻译后修饰(post-translational modification，PTM)密切相关。蛋白质泛素化是一种关键的翻译后修饰，需要E3泛素连接酶，通过介导泛素转移至底物决定底物特异性，进而调节蛋白质的稳定性、分布和功能，几乎控制着细胞中每个生物过程。神经前体细胞表达发育性下调蛋白4(neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated protein 4，NEDD4-1)属于E3泛素连接酶E6蛋白c端同源基因(homologous to E6 associated protein C terminus，HECT)NEDD4样家族成员。近年，越来越多的证据[1，4]表明，NEDD4-1的异常调控决定着癌症的发生发展(包括细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭、上皮-间充质转化、癌症干细胞和耐药性等)走向。但在不同癌症中涉及机制不同，发挥的主要作用也不同，所介导的肿瘤特性更不完全一样。查阅文献发现，目前尚无综述全面阐明NEDD4-1在消化系统肿瘤中的重要作用及作用机制。但研究NEDD4-1在不同肿瘤间是否存在相关性，在同一系统的不同肿瘤中是否引起相同的生物学作用，对NEDD4-1能否进入临床应用具有非常重要的现实意义。本文就NEDD4-1在不同消化系统肿瘤中的研究进展进行综述，为癌症的预防(诊断标记物)和治疗(药物靶点)提供新的思路，进一步突出NEDD4-1在临床应用中广阔的治疗前景。

1 神经前体细胞表达发育性下调蛋白4概述

NEDD4-1基因在真核生物中高度保守，是E3 HECT泛素连接酶NEDD4家族中首位被发现的成员。在人类中该家族共由9位成员组成，即NEDD4(NEDD4-1)、NEDD4L(NEDD4-2)、ITCH(AIP4)、SMURF1、SMURF2、WWP1、WWP2、NEDL1(HECW1)和NEDL2(HECW2)。人类的NEDD4-1基因位于染色体15q21.3上，由30个外显子组成，能转录出5种不同的蛋白质，相对分子质量约为120 kD。NEDD4-1蛋白具有在NEDD4家族之间共享的模块化结构，该结构由氨基末端的钙依赖性C2结合域，3～4个 WW蛋白质-蛋白质相互作用域和羧基末端催化泛素连接酶的HECT结构域组成，见Fig.1。

Fig.1 Structure diagram of NEDD4-1 The C2 binding domain is a calcium binding domain.Once it binds to Ca2+, it can target phospholipid membranes and some protein substrates.The WW domain interacts with the proline-rich PPXY base sequence of the target protein to mediate interactions with substrates and adaptor proteins.The HECT domain catalyzes the formation of thioester bonds with activated ubiquitin and then transfers the ubiquitin directly to a specific substrate

NEDD4-1广泛表达于心、肺、脑、体节和肾等组织，并参与人体多种细胞调控[5]。NEDD4-1主要通过调节膜表面生长因子受体(例如成纤维细胞生长因子受体1)、10号染色体上缺失的MMAC1磷酸酶和张力蛋白同源物(MMAC1 phosphatase and tennis homolog deleted on chromosome 10，PTEN)等[6]进行多泛素化K48、K63[7][8]或单泛素化K6、K27[9]来催化其底物的降解，发挥多种调控作用。Mund等[10]发现，α-突触核蛋白也是NEDD4-1的重要底物之一。相关研究还发现，NEDD4-1的异常调节在自噬[11]、应激反应[12]和癌症[13]等多种生物过程中发挥关键作用。

2 神经前体细胞表达发育性下调蛋白4与肿瘤

现阶段已被发现的NEDD4-1发挥重要作用的癌症包括肺癌、肝细胞癌和前列腺癌等涉及多个系统肿瘤。根据相关调查显示，NEDD4-1在这些肿瘤中的表达水平并不相同，甚至完全相反。详情见Table 1。许多研究也发现，NEDD4-1在肿瘤的发生发展过程中，既有癌基因[14][15]又有抑癌基因[16]作用。这些差异也更加说明NEDD4-1在不同肿瘤间可能参与的信号通路不同(消化系统肿瘤中NEDD4-1主要涉及的信号通路见Fig.2)，所发挥的主要作用也不相同。现有研究发现：在肺癌[17][18]、神经胶质细胞瘤[19]等癌症中，NEDD4-1主要介导癌细胞的侵袭转移，促进癌症发生发展；在鼻咽癌[20]和多发性骨髓瘤[21]等癌症中，NEDD4-1主要克服其他医疗方案所引起的获得性耐药，为化疗等方案提供了新机遇和研究方向；在乳腺癌[22]中NEDD4-1可维持乳腺癌干细胞的种群和特征，为癌症干细胞标志物的靶向治疗提供了新的实验数据。

Table 1 Expression levels of NEDD4-1 in related tumors

Fig.2 The NEDD4-1-related signal pathways in the digestive system The signal pathways shown in the figure from left to right are PTEN/PI3K/AKT，TGF-β，LDLRAD4，EGFR，Myc-SIRT2，Hippo and WNT

3 神经前体细胞表达发育性下调蛋白4与消化系统肿瘤

3.1 NEDD4-1促进肝细胞癌的增殖与迁移能力

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌类型，现居全球事件性癌症首位和第4大癌症相关死亡原因[23][24]。Bellet等[25]研究最先发现，NEDD4-1与调节正常和异常肝细胞的生长联系密切。随后，相关研究进一步阐明，与正常肝细胞相比，癌细胞中NEDD4-1表达明显增高并促进癌细胞增殖和迁移的功能。但Wan等[26]最新研究发现，NEDD4-1在HBV感染引起的HCC细胞中表达低于正常水平，并通过泛素化K48的方式降解HBV X蛋白(HBx)，抑制肿瘤的进展。但可惜的是，HBx的上调还会逆转NEDD4-1过表达诱导的增殖和迁移性抑制。这是一个非常新颖且更高水平的认识，但是首次发现，并存在较多的局限性，需要大量实验联系相关的上游和/或下游信号转导通路判断是否可行。但不可否认的是通过药物等多种方法放大NEDD4-1降解HBx的作用或可成为HBV阳性HCC的高效治疗手段。诱导细胞凋亡经常被认为是癌症中一种潜在治疗策略，在Zheng等[27]、Liao等[28]研究中发现，NEDD4-1是HCC中一种新型的转移相关基因，并显示出抑制细胞凋亡(特别是在营养受限的条件下)。因此，肿瘤的“饥饿疗法”对HCC可能具有更卓越的疗效。也由此提示，从NEDD4-1入手限制临床癌细胞恶化和扩散是一种非常有效的治疗方案。此外，有些调查还发现，NEDD4-1上调还与总体生存率差明显关联。NEDD4-1低表达肿瘤患者平均累积生存期为64.9±6.5个月，而高表达患者为20.3±15.8个月[29]。说明NEDD4-1很可能是预测HCC预后不良的特殊生物标志物。

NEDD4-1发挥上述重要作用与HCC中多种信号通路异常调节密切相关，包括低密度脂蛋白受体A类结构域蛋白4(low-density lipoprotein receptor class A domain-containing protein 4，LDLRAD4)[30]、TGF-β[31]、Hippo[32]、BAX抑制跨膜蛋白1(transmembrane BAX inhibitor motif-containing protein 1，TMBIM1)[33]等。有研究[34]发现，NEDD4-1与PTEN在HCC中定位一致。沉默NEDD4-1将导致PTEN表达上调，使PTEN负向调控PI3K信号通路，发挥其作为肿瘤抑制因子的功能，从而抑制过度活跃的PTEN/PI3K/AKT通路级联。由此提示，HCC患者很可能受益于NEDD4-1联合PTEN/PI3K/AKT信号通路的抑制。此外，Huang等[29]研究表明，PTEN的上调还会引起细胞外信号调节激酶1/激酶2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、信号传导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等多条通路失活，进而阻滞细胞周期、改变细胞骨架、抑制细胞迁移和侵袭能力。NEDD4-1抑制剂对未来治疗HCC具有非常重要的现实意义，但要注意多种通路阻断所带来的副作用。

3.2 NEDD4-1既可促进胰腺癌进展又能抑制胰腺癌发生

胰腺癌是一种致死性疾病，通常被发现于晚期，不仅发病率逐年上升，预后也是在所有癌症中排名最后(5年净生存率不到10%)[35][36]。随着现代医学的发展，新的手术技术和药物疗法(例如腹腔镜技术和新辅助放化疗)[37]不断引入，胰腺癌患者的管理方法已有所发展，但也只引起了适度的改善，未获得质的提升。因此，寻找新的高效生物标志物是治疗胰腺癌问题中最有效的解决途径。

Weng等[38]大量研究发现，NEDD4-1在胰腺癌细胞中表达异质(不均一)，但均明显高于正常胰腺导管上皮细胞。同时敲低NEDD4-1进行研究产生了癌细胞的增殖和迁移能力下降的趋势。这些数据均提示，NEDD4-1对乳腺癌的发生发展发挥关键的致癌作用。姜黄素是从香料姜黄植物根中分离出来的一种具有生物活性的二芳基庚烷类成分，能有效抑制癌细胞增殖并诱发细胞凋亡。Su等[39]研究发现，姜黄素通过抑制胰腺癌细胞中NEDD4-1基因表达，负向调节p73及PTEN蛋白水平来发挥相应作用的机制。这为证明NEDD4-1通过PI3K/Akt信号通路影响胰腺导管腺癌的进展和转移提供了有力的证据，也由此提示，姜黄素灭活NEDD4-1是胰腺癌非常有前途的干预治疗方法。

但是，Liu等[40]研究发现，胰腺癌细胞中c-Myc癌蛋白增加并上调组蛋白去乙酰化酶沉默信息调节因子2(silence information regulator 2，SIRT2)表达，而SIRT2最显著抑制基因却是NEDD4-1。更重要的是，NEDD4-1还会直接结合胰腺癌细胞中c-Myc癌蛋白，并靶向c-Myc癌蛋白进行泛素化和降解。这种环路的相互作用揭示了一种治疗胰腺癌的新途径，即通过NEDD4-1，采取一种全新的方法稳定c-Myc癌蛋白。经过进一步研究发现，小分子SIRT2抑制剂可重新激活NEDD4-1基因表达，降低c-Myc癌蛋白的表达，进而抑制胰腺癌细胞的增殖。因此，寻找更安全有效的SIRT2抑制剂，可成为胰腺癌治疗相对较新颖、潜力大的治疗方案。但值得注意的是，Liu等研究结果与Weng等并不完全相同，即NEDD4-1在胰腺癌中表达下调并发挥着抑癌因子的作用。

综上，尽管绝大多数研究都发现了NEDD4-1的致癌因子作用，但它同样可以通过与c-Myc癌蛋白和SIRT2的环路发挥抑制作用，从而发挥抑癌因子的作用并显示出更复杂的基因表达模式。同时提示，无论上述研究结果的差异如何，都证明了NEDD4-1对胰腺癌的发生发展具有不可忽略的影响，满足成为胰腺癌有效的生物标志物条件。重点是阻断NEDD4-1与PI3K/AKT信号通路的联系，而不影响其在c-Myc癌蛋白环路中的抑癌作用对胰腺癌的治疗方案或许会有巨大的帮助。

3.3 NEDD4-1促进胃癌恶化、转移

胃癌是全球第5大癌症和第3大最常见的癌症死亡原因[41]。经相关调查[42]显示，2015年，我国胃癌发病率为男性中标率26.54/10万，女性中标率11.09/10万；死亡率为男性中标率18.75/10万，女性中标率为7.72/10万。

贲门腺癌(gastric cardiac adenocarcinoma，GCA)是胃癌中最具侵略性的亚型，其死亡率远远超过胃癌，预后极其不良。有研究证实，NEDD4-1在GCA中表达上调并可成为专属于GCA的一种极特殊的预后标志物。特别是处于TNM II期和III期的NEDD4-1阴性患者5年生存率均高达100%[43]。因此，免疫组化检测NEDD4-1水平，非常适用于临床指导GCA的治疗(与阳性患者区别治疗)及预测术后生存指标。此外，Li等[44]研究表明，DNA甲基化抑制剂地西他滨(decitabine，DAC)通过上调NEDD4-1的表达，进而促进明确定义的MGC-803胃癌细胞系的细胞侵袭行为，而对另一种SGC-7901细胞系的侵袭特性无影响。但值得注意的是，在这2种细胞系中癌细胞增殖均受到抑制，却均未被发现PTEN的表达。Yang等[45]进一步研究发现，NEDD4-1表达从正常胃黏膜发展到肠上皮化生长过程呈上升趋势，而从异常增生(不典型增生)发展到胃癌却呈下降趋势，并在原发性肿瘤和邻近的非肿瘤组织中的检查结果类似。但这些趋势均与PTEN的表达无关。由此提示，胃癌中的NEDD4-1作用通路不同于其他消化系统肿瘤，也可能独立于PTEN或其他通路直接发挥作用。这意味着，NEDD4-1在某些不清楚的方面促进胃癌的发生发展，仍需要大量研究进一步测定。Li等[44]研究也更进一步揭示了，地西他滨在不同胃癌细胞系中发挥不同作用，可为今后考虑地西他滨的临床应用提供参考。在其他研究[43]发现，NEDD4-1介导的EGFR依赖性胃癌细胞的侵袭和迁移能力增加，提示NEDD4-1很可能参与EGFR介导的肿瘤转移信号通路。但NEDD4-1如何介导EGFR依赖性细胞迁移和侵袭的信号转导，是了解NEDD4-1在肿瘤发生和发展中作用的重要问题，需要进一步研究。相关研究还发现其他信号通路，例如TNF受体相关因子2(TNF receptor associated factor 2，TRAF2)、干扰素调节因子3亚型1(interferon regulatory factor 3 isoform 1，IRF3)等[46]。

3.4 NEDD4-1提高结直肠癌耐药性并抑制肠道肿瘤生长

结肠癌是一种较为常见的消化道恶性肿瘤，多发生于结肠与直肠的交界处，以突变积累和免疫应答失调为特征[47]。随着其发病年龄的年轻化，已被归为早发性疾病范畴[48]。有较早研究结果[49]已证实，NEDD4-1的过表达可作为结直肠癌的一个显著特征，在癌症的发生发展中发挥重要调控作用。Yue等[50]最新研究发现，NEDD4-1在结肠癌组织中大量表达。体内研究显示，过表达NEDD4-1促进了小鼠模型中异种移植瘤的生长和转移，提高了原发性结肠癌的成瘤率。体外研究显示，沉默(或上调)NEDD4-1可抑制(或增加)结肠癌细胞的活力、侵袭力和上皮-间充质转化。这提示，NEDD4-1的上调促进了肿瘤的转移，并可作为结直肠癌有效的鉴别生物标志物和可行治疗靶标。此外，Hong等[51]人研究指出，NEDD4-1通过与p34直接作用影响PTEN的单泛素化和多泛素化，进而增强癌细胞的生存、增殖和抗癌药物的耐药性。而p34阴性、NEDD4-1阳性的结肠癌肿瘤中PTEN水平并不受影响。因此，p34是NEDD4-1和PTEN致瘤行为的关键调控因子。但也有研究证实，NEDD4-1在结肠癌肿瘤中的致癌作用其实并不主要由PTEN所介导。Eide等[52]研究发现，NEDD4-1的消耗并不影响PTEN蛋白水平或PI3K/AKT信号通路的激活。此外，NEDD4-1的异位表达对PTEN的亚细胞定位和蛋白质水平均无影响，但会引起癌细胞发育。由此提示，NEDD4-1在结肠癌肿瘤中最特殊，能够独立于PTEN和PI3K/AKT信号通路促进结肠癌细胞的生长。

NEDD4-1的致癌作用在结直肠癌中是最受争议的。有些研究已经证明，NEDD4-1在抑制结直肠癌的发展中发挥关键作用。Lu等[53]人研究结果表明，仅仅缺失NEDD4-1并不会导致肿瘤的形成。然而，一旦驱动肠道肿瘤形成，NEDD4-1就会发挥抑制此类肿瘤生长的作用。进一步研究发现，当NEDD4-1蛋白水平降低/丢失时，YY1(WNT信号通路上游效应因子)表达增强，增加对DN-淋巴增强结合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1)转录的抑制，导致FL-LEF1/DN-LEF1转录比例增加，从而进一步增强已经被突变激活的WNT通路的激活。这些结果均表明，NEDD4-1至少部分通过抑制转录因子LEF1和YY1，进而抑制了结肠肿瘤中WNT信号通路和肿瘤生长。笔者认为，在上述研究结果中，NEDD4-1的过表达很可能属于一种细胞代偿机制，试图通过降低WNT信号来抵消其过度活跃和肠道肿瘤生长。也由此提示，NEDD4-1参与的WNT信号通路非常有希望成为治疗结直肠癌的新靶点之一。

4 问题与展望

综上所述，NEDD4-1在消化系统肿瘤中既可促进癌症的发展，又可抑制癌症的进一步恶化。此现象在神经胶质母细胞瘤[40，54]中也被发现，但具体机制仍然不清。这也提示我们，对于NEDD4-1的研究仍不够深入，不同研究之间仍存在模糊或相悖的结论，需要进一步探讨。此外，NEDD4样蛋白家族的其他成员也在不同恶性肿瘤中发挥一定的作用[55，58]。一些研究[59，60]发现，NEDD4L在肺癌中发挥抑癌基因的作用，并通过与癌基因NEDD4-1的平衡关系，对抑制肺癌的转移及肺癌患者、胎儿等肺功能至关重要；其他相关研究还发现，NEDD4L[61]、WWP2[62]、SMURF1[63]共同作用于神经胶质细胞瘤的发生发展，其间一定存在某种潜在的促进/抑制作用。因此，联系NEDD4-1与其他成员间的相互作用可能有利于癌症治疗方案的进一步优化。尽管上述问题均需要大量研究及许多作用机制去解释，但可以期待的是，NEDD4-1与其相关的潜在通路及靶标将会在未来预防及治疗恶性肿瘤中发挥不可忽视的作用。