微生物法去除柚子皮苦味的工艺研究

戚启琼，韦倩妮，唐秋霞，莫培铭，张美林

（北海职业学院，广西北海 536100）

柚子果肉口感好，柚子皮的活性成分多，但柚子皮味辛苦甘，其苦味在使用柚子皮制作产品时影响较大，因此在开发利用柚子皮制作果脯、果酒等产品时，需去除柚子皮的苦味物质[1-2]。柚子皮味苦，但不同品种、不同部位的苦味程度差距较大，其中柚皮苷是主要苦味物质。本文利用微生物乳杆菌发酵法去除柚子皮中的苦味物质柚皮苷，通过接种、发酵培养，利用柚皮苷标准品制作标准曲线，紫外分光光度计于420 nm处测柚皮苷的含量，从而判定乳杆菌去除柚子皮中柚皮苷的效果[3-4]。

1 材料与方法

1.1 菌种

乳杆菌，上海保藏生物技术中心

1.2 材料

柚皮干，市售；纤维素酶、果胶酶，河南万邦实业有限公司；蛋白胨、牛肉膏，北京奥星生物技术有限公司；葡萄糖、酵母浸膏，广东环凯生物科技有限公司；硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钠、氢氧化钠和盐酸，广东省化学试剂工程技术研究开发中心；一缩二乙二醇，国药集团化学试剂有限公司；柚皮苷标准品，标准品库——中药对照品。

1.3 仪器与设备

紫外分光光度计，上海翱艺仪器有限公司；超净工作台、高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；离心机，四川蜀科仪器有限公司；振荡培养箱，金坛市宏华仪器厂。

1.4 实验方法

1.4.1 柚皮浆的配制

①柚子复水。柚子皮与蒸馏水的比例为1∶10，浸泡过夜。②打浆。将切成小块的柚子皮放入破壁机加蒸馏水打成浆。③酶解。将打好的柚皮浆倒入烧杯，加入0.5%果胶酶和0.5%纤维素酶，放在45 ℃ 恒温水浴锅中酶解1 h，期间要不断搅拌。④调节pH值。柚皮浆酶解完成后用1 mol/L碳酸钠溶液调节pH值至6.5。⑤灭菌。调节好pH值的柚皮浆放在高温灭菌锅中95 ℃灭菌15 min，冷却至室温，备用。

1.4.2 培养基的配制

称取磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.2 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏5 g和酵母浸膏4 g，加1000 mL 蒸馏水搅拌溶解，用1 mol/L盐酸溶液调整pH值至6.5，分装到三角瓶中，包扎，于121 ℃灭菌 20 min。

1.4.3 活化、接种与发酵

将乳杆菌接入培养基后于振荡培养箱中30 ℃ 180 r/min振荡培养24 h，得到乳杆菌种子液，调整乳杆菌溶液的OD值为0.359。在无菌操作下将乳酸杆菌液和已灭菌的柚皮浆接入培养基中，于振荡培养箱中180 r/min振荡培养24 h。

1.4.4 离心和检测

取出1.4.3得到的发酵液，于离心机4000 r/min离心10 min，取上清液检测柚皮苷含量。

1.4.5 制作柚皮苷标准曲线

（1）配制4 mol/L氢氧化钠。称取16 g氢氧化钠于小烧杯中，加入少量蒸馏水使用玻璃棒搅拌进行溶解，溶解后转入100 mL容量瓶中，使用蒸馏水润洗烧杯和玻璃棒，将润洗的蒸馏水也转入容量瓶中，反复操作两次，最后定容到刻度线摇匀即可，备用。

（2）配制柚皮苷标准使用液。准确称取8 mg柚皮苷标准品置于小烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，再转入100 mL容量瓶中，使用少量蒸馏水冲洗小烧杯和玻璃棒，冲洗的蒸馏水也转入容量瓶中，反复操作两次，最后加蒸馏水定容至刻度线，摇匀备用。

（3）制作柚皮苷标准曲线。取6支具塞试管，分别加入0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL柚皮苷标准使用液，再加入5 mL、4 mL、3 mL、 2 mL、1 mL、0 mL空白液于试管中。分别加入 5 mL 90%二甘醇（一缩二乙二醇）和0.1 mL 4 mol/L氢氧化钠，摇匀后置于40 ℃恒温水浴锅中显色10 min，立即使用分光光度计在波长420 nm处测吸光度，以柚皮苷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，得到柚皮苷标准曲线，见图1[5]。标准曲线方程为y= 0.2829x+0.0175，R2=0.9994。

图1 柚皮苷标准曲线

1.4.6 单因素试验设计

（1）乳杆菌添加量的单因素试验。准备4个 100 mL的培养基，在4个培养基内分别加入5%、10%、15%和20%的乳杆菌，再分别加入40%的柚皮浆在25 ℃下培养24 h，培养完成后离心，取0.5 mL上清液，加入5 mL一缩二乙二醇和0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，摇匀后在30 ℃恒温水浴中保温显色30 min，在440 nm波长下测吸光度值。测试时以0.5 mL蒸馏水加入同比例其他试剂作空白对照。同时做不加乳杆菌的柚皮浆的培养基摇瓶发酵。

（2）柚皮浆添加量的单因素试验。在4个培养基内分别加入40%、50%、60%和70%的柚皮浆，再分别加入5%的乳杆菌在25 ℃下培养24 h，培养完成后离心，取0.5 mL上清液，加入5 mL一缩二乙二醇和0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，摇匀后在30 ℃恒温水浴中保温显色30 min，在440 nm波长下测吸光度值。测试时以0.5 mL蒸馏水加入同比例其他试剂作空白对照。同时做不加乳杆菌的柚皮浆的培养基摇瓶发酵。

（3）培养温度的单因素试验。在4个培养基内，分别加入40%的柚皮浆和5%的乳杆菌，分别在 25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下培养24 h，培养完成后离心，取0.5 mL上清液，加入5 mL一缩二乙二醇和0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，摇匀后在30 ℃恒温水浴中保温显色30 min，在440 nm波长下测吸光度值。测试时以0.5 mL蒸馏水加入同比例其他试剂作空白对照。同时做不加乳杆菌的柚皮浆的培养基摇瓶发酵。

（4）培养时间的单因素试验。在4个培养基内，分别加入40%的柚皮浆和5%的乳杆菌，在25 ℃下分别培养24 h、48 h、72 h和96 h，培养完成后离心，取0.5 mL上清液，加入5 mL一缩二乙二醇和 0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，摇匀后在30 ℃恒温水浴中保温显色30 min，在440 nm波长下测吸光度值。测试时以0.5 mL蒸馏水加入同比例其他试剂作空白对照。同时做不加乳杆菌的柚皮浆的培养基摇瓶发酵。

1.4.7 柚皮苷降解率

柚皮苷降解率计算公式为：

2 结果与分析

2.1 乳杆菌添加量对柚皮苷降解率的影响

由表1可知，乳杆菌添加量为5%时，柚皮苷浓度最低，柚皮苷降解率最高。因此，加入乳杆菌添加量为5%时最优。

表1 乳杆菌添加量对柚皮苷浓度的影响

2.2 柚皮浆添加量对柚皮苷降解率的影响

由表2可知，柚皮浆添加量为50%及以上时，乳杆菌不能将柚皮苷分解，发酵液中柚皮苷含量随着柚皮浆添加量增加而上升。因此，在柚皮浆的添加量为40%时柚皮苷降低率最大，故柚皮浆添加量为40%时最优。

表2 柚皮浆添加量对柚皮苷浓度的影响

2.3 培养温度对柚皮苷降解率的影响

由表3可知，柚皮苷降解率随着培养温度的升高先升高后降低，当培养温度为35 ℃时，柚皮苷浓度最低，柚皮苷降解率最高。因此，在培养温度为35 ℃时最优。

表3 培养温度对柚皮苷浓度的影响

2.4 培养时间对柚皮苷降解率的影响

由表4可知，柚皮苷降解率随着培养时间的延长先升高后降低，培养时间为48 h时，柚皮苷浓度最低，柚皮苷降解率最高。因此，培养时间为48 h时最优。

表4 培养时间对柚皮苷浓度的影响

3 结论

本文采用微生物法研究去除柚子皮的苦味，从乳杆菌添加量、柚皮浆添加量、培养温度和培养时间4个方面进行单因素试验得到去除柚子皮苦味的最佳条件。结果表明，当乳杆菌添加量为5%、柚皮浆添加量为40%、培养温度为35 ℃、培养时间为 48 h时为最优方案。