小青龙汤对支气管哮喘大鼠黏液高分泌及气道炎症的影响*

孟泳

河南中医药大学第二附属医院，河南省中医院，河南 郑州 450002

支气管哮喘简称哮喘，是呼吸系统常见的气道慢性炎症疾病，由多种细胞和细胞组分参与，严重危害公众健康[1-3]。气道炎症、黏液高分泌与嗜酸性粒细胞浸润是支气管哮喘的主要特征[4-6]，亦是诱发其反复发作的重要因素。小青龙汤出自《伤寒论》，具有温肺化痰、止咳平喘之功。《伤寒论·辨太阳病脉证并治》曰：“伤寒表不解，心下有水气……少腹满，或喘者，小青龙汤主之。”研究显示，小青龙汤可有效缓解支气管哮喘患者的症状，改善哮喘患者肺功能，降低气道炎症[7-9]。现代药理研究表明，小青龙汤具有抗感染、调节机体免疫、抗过敏、缓解气道痉挛等功效[10-11]。既往研究发现，黏蛋白(mucin，Muc)5ac和Muc5b在哮喘模型中的高表达往往与气道黏液高分泌呈正相关[12-13]。而关于小青龙汤是否通过调控Muc5ac与Muc5b缓解哮喘症状鲜有报道，基于此，本研究以哮喘大鼠为研究对象，探讨小青龙汤对Muc5ac与Muc5b表达及气道炎症的影响，为小青龙汤防治哮喘提供一定的科学依据。

1 材料

1.1 动物60只3月龄SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量(200±20) g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2019-0002。动物饲养条件为实验室室温：(25±1)℃；相对湿度：(50±10)%；使用灭菌饲料与纯水进行喂养。本实验由河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)实验动物伦理委员会审查通过，伦理批号：PZ-HNSZYY-2022-020。所有实验大鼠的饲养、雾化、灌胃等严格遵照实验动物伦理协会规定的动物伦理福利条款进行。

1.2 药物与试剂氨溴索(规格：15 g/2 L，上海信谊药业，国药准字：H20057982)；鸡卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)、氢氧化铝[Al(OH)3](美国Sigma Aldrich公司，批号：SLBK6455V、WXBB1151V)；白细胞介素-13(interleukin-13，IL-13)、IL-6、IL-10、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)、Muc5ac、Muc5b ELISA试剂盒(美国Cusabio公司、批号：CSB-E04602m、CSB-E04640r、CSB-E04594m、CSB-E08914m、CSB-E11040m、CSB-E15067m)；SYBR Green qPCR Mix荧光定量PCR试剂盒(广州东盛生物科技有限公司，批号：SJ6038-5)。

1.3 仪器RM2145 型自动切片机(德国徕卡公司)；OLYMPUS-DP70 型显微镜及显微照相系统(日本奥林巴斯株式会社)；Image-Pro Plus 6.0 型专业图像分析系统(美国 Media Cybernetics公司)；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；LABOFUGE 400 R型低温高速离心机(德国Heraeus公司)；Multiskan MK3型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Fine Pointe PFT型动物肺功能检测系统(美国Buxco公司)。

2 方法

2.1 药物制备由河南省中医院药理实验室按小青龙汤的组成比例用水煎醇沉法制备小青龙汤提取液，具体如下：取小青龙汤组方药材麻黄10 g，桂枝10 g，干姜15 g，细辛3 g，姜半夏15 g，甘草6 g，白芍10 g，五味子9 g，将上述药品粉碎，水煎2次，合并滤液并蒸发水分成膏状，用体积分数95%乙醇沉淀，蒸干滤液，过大孔树脂。再用水和体积分数40%乙醇、体积分数70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱后，除尽溶剂，配制成2 kg·L-1(含生药)水溶液，备用。

2.2 动物分组、造模与给药60只SPF级SD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、氨溴索组、小青龙汤高剂量组、小青龙汤中剂量组及小青龙汤低剂量组，每组10只。除对照组外，其余组大鼠建立支气管哮喘模型[14]，具体如下：造模大鼠分别于第1天、第7天及第14天腹腔注射质量浓度10%OVA/Al(OH)3混悬液[0.1 g OVA和0.1 g Al(OH)3溶于生理盐水混合液]1 mL致敏，并于第15天开始雾化吸入含1%OVA的生理盐水雾化激发，隔日1次，每次 30 min，共计2周，以大鼠出现呼吸急促、抓耳挠腮、行动迟缓等行为为模型建立成功。对照组大鼠分别使用生理盐水进行腹腔注射和雾化。造模成功后，小青龙汤低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠分别给予 14 g·kg-1、7 g·kg-1、3.5 g·kg-1的小青龙汤溶液灌胃[15]，氨溴索组大鼠灌胃给予15 mg·kg-1氨溴索，对照组及模型组灌胃给予等量生理盐水，每天1次，连续14 d。

2.3 观察指标

2.3.1 肺功能及气道阻力末次灌胃给药24 h后，腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠。将大鼠固定在操作台上，局部消毒颈部皮肤，沿中线剪开胸腹腔皮肤直至颈部，钝性分离皮下组织，暴露气管。在气管环状软骨下剪小口，插入18 G注射器针头(尖头磨平)并结扎固定，连接大鼠肺功能仪检测大鼠肺功能，记录第0.3秒用力呼气容积(forced expiratory volume，FEV0.3)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)和呼气峰流量(peak expiratory flow，PEF)值。通气数分钟后，测大鼠呼吸道阻力(air way resistance，R)作为基础值，给予大鼠雾化，依次吸入蒸馏水、不同浓度(0 g·L-1，4 g·L-1，8 g·L-1，12 g·L-1、16 g·L-1)的乙酰甲胆碱各15 s后记录气道阻力值。

2.3.2 肺泡灌洗液中炎性细胞分类计数在取材前将大鼠禁食不禁水12 h，处死动物，剥离出肺组织和气管，用4 ℃生理盐水注入左支气管进行灌注，每次2 mL，灌注3次，每次灌注完成后反复抽吸3次，回收肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid，BALF)并离心，去上清液，-80 ℃保存备用，底层细胞用瑞氏-姬姆萨进行复合染色，计数BALF中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的数目。

2.3.3 BALF中细胞因子水平采用ELISA试剂盒检测BALF中IL-13、IL-6、IgE、IL-10、Muc5ac以及Muc5b水平，所有操作均严格按照试剂盒说明书的要求。

2.3.4 肺组织Muc5acmRNA、Muc5bmRNA表达水平采用实时荧光定量PCR方法检测肺组织Muc5acmRNA、Muc5bmRNA表达水平。称取肺组织50 mg，加入1 mL Trizol，在液氮中充分研碎后室温静置5 min；加入 0.2 mL 氯仿，充分震荡，静置3 min；4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，移上清至新的EP管；加入与上清等量的-20 ℃预冷的异丙醇，混匀，冰浴10 min；4 ℃ 12 000 r·min-1离心 15 min，弃上清；加入1 mL 75%乙醇，混匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，弃上清；75%乙醇重复洗涤1次，弃上清，室温晾干20 min，加入20 μL DEPC水，将得到的RNA充分溶解。进行总RNA提取及RNA样本纯度测定后将提取得到的RNA反转录为cDNA，使用SYBR Green qPCR Mix试剂进行荧光定量PCR。引物由深圳市豪地华拓生物科技有限公司合成，引物序列如下：Muc5ac正向：5′-GTGTCGGCCGGAGAAA-GTTGGT-3′，反向5′-GTCCTGTTGAGCCTGGCCTGTG-3′；Muc5b正向：5′-TTACACCTGGCACACAATGG-3′，反向5′-TCCAGCTTCTGCAAGTTTCC-3′；β-actin正向5′-CTGTGTACTGAGCATTCCTGTGACT-3′，β-actin反向 5′-AGCCTCCTGTAGAGCTGTGACTGAA-3′。反应体系：正向引物 1 μL、反向引物1 μL、cDNA 2 μL、SYBR Green qPCR Mix 3 μL、双蒸水(ddH2O)8 μL。PCR循环条件如下：95℃预变性5 min，95 ℃变性 10 s，60 ℃退火、延伸30 s，进行40个循环。使用β-actinmRNA进行标准化，以 2-ΔΔCt表示待测基因mRNA相对表达量。

3 结果

3.1 各组大鼠肺功能比较与对照组比较，模型组大鼠FEV0.3、FVC和PEF降低；与模型组比较，小青龙汤各剂量组FEV0.3、FVC和PEF升高，且呈剂量依赖性，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组哮喘大鼠肺功能指标比较

3.2 小青龙汤对大鼠气道反应性的影响激发前，与对照组比较，模型组大鼠气道阻力升高；与模型组比较，各给药组大鼠气道阻均降低。在经不同浓度乙酰甲胆碱激发后，与对照组比较，模型组哮喘大鼠气道阻力值升高；与模型组比较，小青龙汤各剂量组哮喘大鼠气道阻力值降低，且呈剂量依赖性；与 0 g·L-1乙酰甲胆碱激发比较，随着乙酰甲胆碱浓度的升高，模型组、氨溴索组及不同浓度的小青龙汤组气道阻力均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 小青龙汤对不同浓度乙酰甲胆碱激发后各组哮喘大鼠气道阻力的影响

3.3 各组哮喘大鼠BALF中炎性细胞数量比较与对照组比较，模型组哮喘大鼠BALF中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数目均升高；与模型组比较，小青龙汤各剂量组哮喘大鼠BALF中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数目降低，且呈剂量依赖性，差异均具有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 各组哮喘大鼠BALF中炎性细胞数量比较

3.4 各组哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE及IL-10水平比较与对照组比较，模型组哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE的水平升高，IL-10的水平降低；与模型组比较，小青龙汤各剂量组哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE的水平降低，IL-10的水平升高，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE及IL-10水平比较

3.5 各组哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白

表达含量比较与对照组比较，模型组哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表达水平升高；与模型组比较，小青龙汤各剂量组哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表达水平降低，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表达含量比较

3.6 各组哮喘大鼠肺组织Muc5acmRNA与Muc5bmRNA表达水平比较与对照组比较，模型组哮喘大鼠肺组织Muc5acmRNA、Muc5bmRNA水平升高；与模型组比较，小青龙汤各剂量组哮喘大鼠肺组织Muc5acmRNA、Muc5bmRNA水平降低，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 各组哮喘大鼠肺组织Muc5ac mRNA与Muc5b mRNA表达水平比较

4 讨论

哮喘属中医学的“哮病”“喘证”等范畴，其病位在肺，常累及脾肾二脏，痰为其主要病理因素。哮喘以正气虚弱、肺卫不固为主，又受六淫邪气、饮食劳倦等因素刺激，导致痰浊壅塞气道，肺的宣发肃降功能失常，临床以“咳嗽、胸闷、气短”等症状为主。现代医学认为，黏液高分泌、气管高反应性与气道炎症等特征是哮喘发生发展的重要因素[16]。既往研究发现，氨溴索对哮喘气道黏液高分泌有明显抑制作用[17]。因此，选用氨溴索作为本研究的阳性对照药物。

小青龙汤由麻黄、桂枝、干姜、细辛、姜半夏、甘草、白芍、五味子组成，具有温肺化痰、止咳平喘之功。《医宗金鉴》所载：“表实无汗，故合麻桂二方以解外，佐干姜、细辛，极温极散使寒与水俱得以汗而解；佐半夏逐痰饮，以清不尽之饮；佐五味收肺气，以敛耗伤之气”。麻黄，首次记载于《神农本草经》，具有发汗平喘、抗氧化等药理活性[18]。桂枝具有抗菌、调节免疫功能、抗感染、抗过敏等药理作用[19]。干姜成分复杂，具有抗炎杀菌、抗氧化、调节免疫等功效[20]。细辛的挥发油作为其主要的有效成分，具有解热、镇痛、抗感染等药理作用[21]。姜半夏中含有有机酸、多糖等多种有效化学成分，具有止咳平喘、抗炎等药理作用[22]。白芍可通过调节Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等多种炎症通路达到免疫调节、抗炎等作用[23]。五味子作为临床常用的中药之一，《神农本草经》中所载：“主益气，咳逆上气”，对免疫系统、呼吸系统都有良好的调节作用[24]。现代药理研究表明，小青龙汤的药效在于对气道异常分泌进行抑制，同时刺激气道平滑肌的扩张，减轻毛细血管通透性[25]，对炎症水平、气道重塑都有一定的抑制作用[26-27]。

哮喘作为一种气道慢性炎症性疾病，在疾病的发生发展过程中，炎症反应发挥着重要作用，BALF中的IL-13、IL-6、IgE及IL-10等细胞因子水平与巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的数目可直接反映大鼠肺组织的炎症水平。当机体接触变应原后，辅助性T细胞(helper T cells，Th)亚群释放IL-13等细胞因子，在炎症级联反应中发挥关键的调节作用。IL-6 主要由单核细胞、巨噬细胞产生，可刺激细胞生长、促进其分化，参与炎症损伤和免疫应答过程[28]。研究发现，IL-6可刺激T淋巴细胞产生IL-4等炎症因子，可使肥大细胞、嗜酸性粒细胞迁移至呼吸道，参与气道炎症反应[29]。此外，临床研究证实，痰中IL-6水平升高提示患者哮喘控制不佳，肺功能下降[30]。在哮喘的发病中，作为免疫球蛋白的一种，IgE介导的Ⅰ型变态反应起着重要的作用，并且IgE水平与气道炎症反应和气道高反应性有关，血清IgE水平增高，则提示有气道高反应性存在[31]。钟志娟等研究者发现，抑制IgE水平的表达，患者哮喘症状及体征明显减轻[32]。既往文献显示，哮喘患者通常伴随不同程度的气道炎症反应，体内的IL-6、IL-13等促炎性因子会以不同方式参与哮喘的发生发展；而IL-10作为抗炎因子，其升高可抑制机体内的过度炎性反应[33]。哮喘大鼠的肺功能指标可反映哮喘大鼠的气道高反应性，本研究采用腹腔注射OVA致敏与雾化吸入OVA激发诱导建立哮喘大鼠模型，可发现大鼠呼吸急促，挠鼻、打喷嚏及喘息等行为，大鼠的气道阻力值升高，且BALF上清液中IL-13、IL-6、IgE及 IL-10 等细胞因子水平含量明显变化，巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的数目升高，哮喘大鼠出现肺组织炎症反应，提示哮喘模型建立成功。给予小青龙汤干预后，能有效降低气道高反应性，改善肺功能指标(FEV0.3、FVC和PEF)，减轻炎症反应(巨噬细胞数、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞)，下调IL-13、IL-6、IgE水平，上调 IL-10 水平。

本研究从中医哮病以痰为病理因素着手，从黏液高分泌这一角度探讨小青龙汤治疗哮喘的作用机制。黏液高分泌是哮喘复发与加重的重要因素。黏液的主要组分为分泌细胞分泌的黏蛋白，Muc5ac和Muc5b是两种分泌型黏蛋白聚合复合物，位于气道上皮杯状细胞内，气道杯状细胞异常增生及气道黏液的高分泌状态可体现其高表达水平[34]。Muc5ac在哮喘模型中的高表达与气道的黏液高分泌呈正相关，可加重气道平滑肌收缩，并诱发气道高反应；而Muc5b则更倾向于体现气道的黏液清除力和气道防御能力。研究显示，Muc5b缺陷的小鼠会诱发气道的慢性细菌感染，并进一步导致严重的气道炎症，甚则气道阻塞[35-37]。本研究发现，小青龙汤可明显抑制Muc5ac、Muc5b的表达，减轻哮喘大鼠黏液高分泌，改善哮喘症状。

综上所述，小青龙汤可有效抑制哮喘大鼠的黏液分泌及气道炎症，缓解哮喘大鼠症状，其作用机制可能与抑制黏蛋白Muc5ac、Muc5b的水平而降低黏液高分泌有关，为临床防治哮喘提供了新的思路。