水解蛋白酶ZL-1在饲料鱼溶浆中的酶解应用

王春晓，郝李振，李旦旦，肖静

水解蛋白酶ZL-1在饲料鱼溶浆中的酶解应用

王春晓1，郝李振1，李旦旦1，肖静2

（1. 济南正隆生物科技有限公司，山东 济南 250109；2. 齐鲁工业大学（山东省科学院） 生物工程学院，山东 济南 250353）

鱼溶浆是鱼粉加工副产物，富含蛋白，浆液粘度大．酶解加工鱼溶浆有利于将大分子蛋白质水解成肽和氨基酸等，降低浆液粘度，从而提高鱼溶浆的营养性及加工运输性．采用单因素实验和正交实验分析法系统研究并优化了利用ZL-1酶解鱼溶浆的工艺条件．得到的最佳酶解条件为：浆料浓度为10%，温度为55 ℃，不调节pH，ZL-1的加酶量为0.75%干物质浓度，酶解时间为2 h．最佳的工艺实验条件的验证结果表明，水解液中的氨基氮含量比优化前提升了129.47%，粘度降低了84.83%，用酶处理鱼溶浆显著增加了其流动性．

鱼溶浆；酶解；氨基氮

鱼粉是目前水产饲料不可或缺的重要原材料之一，是水产动物重要的蛋白来源[1-2]．由于鲜鱼的含水量约占75%[3]，在鱼粉的制作过程中，大量的水溶性物质在蒸煮、压榨后分体形成液体，这些液体即为鱼溶浆[4-5]．

Ahmad[6]等研究了鱼溶浆对大豆浓缩蛋白的增塑和结合作用，证实了鱼溶浆在鱼饲料挤出过程中用作增塑剂和粘合剂的潜力．Espe[7]等发现向大西洋鲑（）基于植物蛋白的日粮中添加鱼溶浆，并不会影响其自愿采食量和改善其生长．我国鱼粉年产量30多万t，每生产1 t鱼粉，大约产生2～3 t榨汁[8]，早期鱼粉生产工艺过程中，这些榨汁通常不经过回收直接向环境中排放，造成严重的环境污染[9-10]．在鱼饲料中添加鱼溶浆代替鱼粉，可有效节约鱼粉，缓解鱼粉生产过程中的环境污染问题，并有促进鱼体生长的作用．周露阳[11]等的研究报道，在黄颡鱼（）日粮中添加8.5%的酶解鱼溶浆可完全替代28%的鱼粉，且酶解鱼溶浆促生长效果优于鱼溶浆．经研究发现，鱼溶浆含有大量的小分子多肽、氨基酸、牛磺酸以及矿物质等有益成分，保留了鱼粉特有的未知生长因子[12]，对水产、畜禽养殖动物具有很好的诱食和促生长作用，是很好的优质动物蛋白源、诱食剂和营养补充剂[13-14]．传统的鱼溶浆要经过加工浓缩后进行售卖，但这些鱼溶浆还含有较多的大分子蛋白质，如胶原蛋白、蛋白胨等[15]，导致物料粘稠，降低了养殖动物的消化利用率．通过加工和酶解处理可以将鱼溶浆中的大分子蛋白质水解成小分子多肽和游离氨基酸，这样不仅可以提高其流动性，还能增加吸收利用率[16-18]．因此，将鱼溶浆经过酶解处理可以进一步地拓展鱼溶浆的应用范围．

近年来，越来越多的生产企业尝试通过酶处理鱼溶浆，提高其利用效率，将其作为替代鱼粉，用作饲料添加剂的最优原料选择[19-20]．为了更好地适应行业需求，结合实际工艺，将酶解鱼溶浆的工艺条件进行优化处理，以酶解液黏度和氨基氮含量作为评价指标，为优质低廉鱼溶浆的开发利用提供较好的途径和方法．

1　材料与方法

1.1　仪器与材料

HT1150ATC型折光仪（郑州南北仪器设备有限公司）；5810R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf）；UV-6100型荧光分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）；NDJ-5S型数字式黏度计（上海衡平仪器仪表厂）；YP6102型电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）；HH-4型恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）．

鱼溶浆（烟台某水产公司）；碱性蛋白酶，中性蛋白酶，菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶（山东隆科特酶制剂有限公司）；鱼溶浆水解蛋白酶ZL-1，ZL-2（实验室研发自配）；甘氨酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，水合茚三酮，果糖，碘酸钾，无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；去离子水（实验室自制）．

1.2　实验方法

1.2.1正交实验设计取相同量的鱼溶浆（干物质浓度为20%），分别加入相应酶活力的ZL-1、ZL-2、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，于55 ℃恒温水浴中分别酶解2 h．酶解结束后，将样品放置90℃水浴中10 min，使酶失活，通过茚三酮比色素法分别检测酶解后溶解中的氨基氮含量．在多种蛋白酶理论最适条件下进行酶解，确定酶解时间，根据测定酶解液的游离氨基氮含量变化为指标确定各蛋白酶的酶解效果．一般以酶解液黏度为检测指标，进行单因素酶解预实验，选定蛋白酶的正交实验因素水平[21]，在单因素实验的基础上，以酶解液的粘度为指标进行实验，每个因素选择温度、浆料浓度和加酶量等3个因素，并设置3个水平，进行L9（33）正交实验[22]．对正交实验结果进行方差和回归分析，从而得出最优的酶解条件组合，并进行实验验证．实验重复3次，实验结果为测定结果的平均值．

1.2.2原料处理将原鱼溶浆（干物质浓度55%左右）按照各实验需求稀释至相应的浆料浓度，分装，并按实验方案添加相应的酶．水浴温度和时间按相应的实验方案安排．酶解完成后取酶解后1/2的鱼溶浆加热蒸煮酶解液进行浓缩，使用折光仪检测浓缩后浆料干物质浓度至50%[23]，室温静置过夜后检测浓缩后浆料的粘性；取另1/2酶解后的鱼溶浆通过6 000 r/min离心3 min，收集上清液，检测游离氨基氮含量．

1.2.3黏性检测使用数字式粘度计检测浓缩酶解液粘度，设置检测参数为：转子3，测速60 r/min，温度为22℃．

1.2.4氨基氮测定方法氨基氮含量的测定采用茚三酮比色法[24]．鱼溶浆蛋白肽的相对分子质量分布及占比、酸溶蛋白氮含量参考国标《GB/T 22729—2008海洋鱼低聚肽粉》中的方法．

1.3　数据分析

采用OriginPro8.5，SPASS8.1，DPS1.0统计软件对数据进行分析处理及图表制作，方差分析的显著性水平为<0.05．

2　结果分析与讨论

2.1　蛋白酶的选择

不同酶对鱼溶浆中氨基氮含量变化的影响见图1．由图1可见，在其它酶解条件相同的情况下，在鱼溶浆中加入等量的不同种类的蛋白酶，酶解2 h后，不同蛋白酶对鱼溶浆酶解后产生的氨基氮含量不同．与空白对照相比，酶解液中氨基氮含量最高的是ZL-1，为6 259.0 mg/L，其次是碱性蛋白酶、胰蛋白酶和ZL-2，分别为5 333.2，4 971.0，4 841 mg/L．而菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶对鱼溶浆具有一定的酶解作用，但酶解效果相对较差．综合实验结果，最终选择氨基氮含量最高的ZL-1进行鱼溶浆酶解条件优化．

2.2　酶解条件的单因素实验结果

2.2.1温度的影响浆料浓度设置为20%，将浆料添加0.5%的ZL-1，分别于40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃的恒温水浴中酶解2 h，将酶解液加热浓缩至干物质浓度为50%，检测酶解液粘性．酶解鱼溶浆的粘性随酶解温度的变化趋势见图2．

图1　不同酶对鱼溶浆中氨基氮含量变化的影响

图2　温度对鱼溶浆粘度的影响

注；不同字母表示组间差异显著（＜0.05），下同．

由图2可见，在其它酶解条件相同的情况下，改变酶解的温度对鱼溶浆的粘度有显著影响，随着恒温温度的不断增加，酶解后的鱼溶浆粘度呈先降低后升高的变化趋势．当温度在55～65 ℃时，粘度趋于平缓，并在55 ℃时达到最低，为162.1 mPa·s，但温度高于65 ℃时，酶的活性受到温度的影响较大，对鱼溶浆的酶解受到影响，因此酶解的鱼溶浆粘度升高．最终确定酶解的最佳温度为55～65 ℃．

2.2.2加酶量的影响浆料浓度设置为20%，在浆料中分别添加0.25%，0.5%，0.75%，1%，1.25%的ZL-1，于55℃恒温水浴中酶解2 h，将酶解液加热浓缩至干物质浓度为50%，检测酶解液粘性．酶解鱼溶浆的粘性随ZL-1用量增加的变化趋势见图3．

由图3可见，ZL-1的用量对鱼溶浆的粘度具有显著影响，随着加酶量的增加，其粘度逐渐降低．当加酶量为0.2%时，浆料的粘度最大，为375.5 mPa·s，继续增加用酶量，粘度快速降低，酶解液的粘度随加酶量增加呈现显著降低趋势；当用酶量为1.25%时，鱼溶浆的粘度最低，为152.0 mPa·s．当鱼溶浆的底物充足时，增加用酶量可以促进鱼溶浆的酶解，增加鱼溶浆的流动性．但是酶解底物的质量是有限的，过量添加的ZL-1无法继续再将鱼溶浆酶解，当加酶量从0.5%逐渐增加到1.25%时，粘度趋于平缓，因此确定鱼溶浆酶解的适宜用酶量为0.5%～0.75%．

2.2.3浆料浓度的影响将干物质浓度为55%的原浆料稀释为10%，15%，20%，25%，30%，分别在其中加入0.5%的ZL-1，55℃恒温水浴中酶解2 h，将酶解鱼溶浆经过加热浓缩到干物质为50%后，检测其粘性．酶解液的粘性随浆料浓度增加的变化趋势见图4．

由图4可见，同样的酶解条件下，初始酶解浆料浓度对酶解后的鱼溶浆粘度具有显著影响，随着浆料浓度的增加，酶解后的鱼溶浆粘度逐渐升高．当浆料浓度为10%时，酶解鱼溶浆的粘度最低，为160.3 mPa·s，随着浆料浓度的增加，酶解后的鱼溶浆粘度逐渐增加．结合实际生产需求，最佳的酶解浆料浓度可为10%～30%．

图3　加酶量对鱼溶浆粘度的影响

图4　浆料浓度对粘度的影响

2.3　酶解工艺正交实验结果

酶解工艺参数优化的正交实验设计及结果见表1．由方差分析可知，酶解温度、浆料浓度、加酶量对粘度均具有显著的影响（<0.05）．对水解度的影响为：浆料浓度>酶解温度>加酶量．经过极差分析可知，经过L9（33）正交实验后，得到ZL-1的酶解最优组合条件为：A1B1C3，即酶解浆料浓度为10%，加酶量为0.75%，酶解温度55℃．

表1　正交实验设计及结果

2.4　最优组合条件验证

选取干物质含量为55%的原鱼溶浆稀释至浓度为10%，加入0.75%的ZL-1，于55℃恒温水浴中水解2 h，然后灭酶处理检测的氨基氮含量，浓缩后测得酶解液的粘度与未做酶处理的鱼溶浆的对比（见表2）．

表2　酶解后各项检测指标的变化

由表2可见，使用理论最优条件组合进行鱼溶浆的酶解，其粘度低于正交实验中所有的粘度值，相较未酶解处理的鱼溶浆粘度降低了84.83%，显著增加了鱼溶浆的流动性．酶解后的鱼溶浆氨基氮含量升高了129.47%，表明ZL-1可以有效将鱼溶浆中的大分子蛋白酶酶解成游离的氨基酸、多肽等物质．

2.5　酶解工艺在其它物理量上应用

将ZL-1的最佳酶解工艺用于蛋白酶酶解效果较好的碱性蛋白酶、胰蛋白酶、ZL-2上，分别检验酸溶蛋白氮含量、分子量占比及口感，结果见表3．

表3　其它物理量的对比应用结果

由表3可见，胰蛋白酶的酸溶蛋白氮含量最高，ZL-1次之，与胰蛋白酶相差不大；在＜500 Da的分子量占比中，ZL-1酶解后的鱼溶浆占100%，平均分子量192.56 Da；在口感上ZL-1、ZL-2的口感较为突出．经过综合比较发现，ZL-1在综合考量下，酶解鱼溶浆的效果最好．

3　结论

（1）以游离氨基氮的含量为检测指标，对多种蛋白酶鱼溶浆进行酶解，ZL-1酶解后的氨基氮含量最高，为最佳用酶选择．

（2）通过单因素实验和正交实验相结合的方法优化得到ZL-1酶解鱼溶浆的酶解工艺参数．ZL-1最佳酶解条件为：酶解浆料浓度为10%，酶解温度为55℃，加酶量为0.75%，酶解时间为2 h．在此条件下进行鱼溶浆的酶解，可得到浓缩后酶解液的粘度为152.3 m Pa·s，相较于未酶解处理的鱼溶浆粘度降低了84.83%，很大程度上增加了鱼溶浆的流动性，酶解后鱼溶浆中游离氨基氮含量也增加了129.47%．

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The enzymatic application of hydrolytic protease ZL-1 in feed fish slurry

WANG Chunxiao1，HAO Lizhen1，LI Dandan1，XIAO Jing2

（1. Jinan Zhenglong Biological-Tech Co.，Jinan 250109，China；2. School of Bioengineering，Qilu University of Technology（Shandong Academy of Sciences），Jinan 250353，China）

Fish slurry is a by-product of fish meal processing，rich in protein and with a high viscosity．The enzymatic processing of fish slurry facilitates the hydrolysis of large molecules of protein into peptides and amino acids etc，which reduces the viscosity of the slurry，thereby improving its nutritional and processing transportability．The process conditions for the enzymatic digestion of fish slurry using ZL-1 were systematically investigated and optimised using single factor tests and orthogonal analysis．The optimum enzymatic conditions were obtained as follows，slurry concentration of 10%，temperature of 55 ℃，no pH adjustment，enzyme addition of ZL-1 at 0.75% dry matter concentration and enzymatic digestion time of 2 h．The validation of the optimum process conditions showed that the amino nitrogen content of the hydrolysate increased by 129.47% compared to the pre-optimisation period．The viscosity was reduced by 84.83% and the treatment of fish slurry with enzymes significantly increased their fluidity．

fish slurry；enzymatic；amino nitrogen

1007-9831（2022）08-0077-05

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.08.015

2022-05-06

王春晓（1990-），女，山东高密人，中级实验师，硕士，从事食品酶应用研发研究．E-mail：jnyfzx002@163.com

肖静（1974-），女，山东泰安人，教授，博士，从事酶制剂应用研究．E-mail：xiaojing8168@163.com