OPN TIMP-2及STAT3蛋白在子宫内膜异位症患者中的表达及临床意义

陈观盛， 郑 蓉

(北京积水潭医院妇产科， 北京 100035)

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMS)是指子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位发生具有生长功能的子宫内膜组织，属于具有恶性生物学行为的良性妇科疾病。在临床中发现，EMS患者异位内膜的黏附、侵袭、血管生成、细胞无限增殖生物学行为均与恶性肿瘤相似[1]。虽然属于良性疾病，但仍会对患者造成较大心理压力，对患者生活也可造成一定影响，早期诊断是治疗与预防EMS发生的关键。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)为分泌性的磷酸化糖蛋白，在大肠癌、卵巢上皮性癌、肝癌等恶性肿瘤中均为高表达，且与肿瘤黏附、转移、凋亡之间关系密切[2]。基质金属蛋白酶组织抑制因子2(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2，TIMP-2)是组织抑制因子中的一员，具有抑制基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPS)的作用，可调控细胞外基质中MMP的降解，在恶性肿瘤的侵袭过程中发挥着重要的作用[3]。在以往多数研究中发现，多种肿瘤中存在信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)过度活化现象，EMS病灶形成与肿瘤转移之间非常相似，因此认为STAT3激活与EMS组织迁徙与侵入可能存在联系[4,5]。基于此，本文旨在分析OPN、TIMP-2及 STAT3蛋白在子宫内膜异位症患者中的表达情况，了解其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2019年1月至2020年1月在本院收治的117例子宫内膜异位症患者临床资料(EMS组)，患者年龄26～60岁，平均(38.77±5.16)岁，根据美国生育协会评分标准(r-AFS)分期[6]，Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期64例；月经周期：增生期66例，分泌期51例。纳入标准：①均经术后病理检查确证(病理检查可见异位内膜伴有周围纤维组织增生和粘连形成，有大小不等的紫蓝色结节或包块。切开结节或包块可看到陈旧性出血和瘢痕。镜下检查可见子宫内膜的腺体及间质。)；②符合EMS疾病诊断标准[6]：患者有疼痛(非经期下腹痛、痛经、深部性交痛等)、不孕、月经失调等症状；超声检查可见子宫的后方或侧方包块，包膜粗糙，内为密集细小强光点反射或不规则反射，彩超包块内无血流；腹腔镜检查下可见病灶。③临床资料完整；④自愿加入本次研究，家属及患者均签署知情同意书。排除标准：①存在感染性疾病或自身免疫性疾病；②合并恶性肿瘤者；③在入院前3个月内有进行内分泌激素治疗者；④存在其他妇科感染性疾病或炎性疾病者。另选取同期收治子宫肌瘤或不孕症行手术治疗的非EMS者103例，年龄26～61岁，平均(39.56±5.37)岁。两组一般资料比较并无差异，具有可比性(P>0.05)。见表1。

表1 一般资料比较

1.2OPN、TIMP-2及STAT3检测方法：使用免疫印迹实验检测TIMP-2及STAT3蛋白含量，所有患者均在术中获取子宫内膜组织100mg，提取蛋白后进行下一步检测，按照配方配置浓缩胶(4%)、分离胶(10%)，将样本加入到点样孔中，垂直进行电泳和电转膜。使用脱脂牛奶(5%)封闭，在2h后根据抗体说明书进行蛋白分子量预测，进行NC膜裁剪，孵育OPN、TIMP-2及STAT3第一抗体。在第2天将NC膜取出，使用TBST洗涤液洗涤3遍后加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2h，再次使用TBST洗涤液洗涤3次进行显影处理，随后使用相应软件对蛋白条带灰度值进行分析，根据基因灰度值/内参actin灰度值作为蛋白含量，令对照组蛋白含量为100，计算蛋白含量。OPN使用酶联免疫法进行检测，在患者入院后抽取静脉血液4mL，使用离心机离心5min(速度3000r/min，半径10cm)试剂为武汉博士德股份有限公司提供。使用酶标仪(美国伯腾仪器有限公司，型号：Synergy H1)检测450nm处的吸光度(OD值)，并绘制标准曲线，计算出相应的浓度，严格按照试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1不同人群中OPN、TIMP-2及STAT3表达情况比较：EMS组OPN、STAT3表达明显高于对照组，TIMP-2水平则明显低于对照组，差异存在统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同人群中OPN TIMP-2及 STAT3表达情况比较

2.2不同分期患者OPN、TIMP-2及STAT3表达情况比较：Ⅲ～Ⅳ期OPN、STAT3表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期，TIMP-2水平则明显低于Ⅰ～Ⅱ期，差异存在统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同分期患者OPN TIMP-2及STAT3表达情况比较

2.3不同月经周期患者OPN、TIMP-2及STAT3表达情况比较：增生期OPN、STAT3表达明显高于分泌期，TIMP-2水平则明显低于分泌期，差异存在统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同月经周期患者OPN TIMP-2及STAT3表达情况比较

2.4OPN、TIMP-2及STAT3与r-AFS分期相关性：EMS患者血清OPN、STAT3值与患者r-AFS分期为正相关，TIMP-2与r-AFS分期为负相关，相关关系存在统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 OPN TIMP-2及STAT3与r-AFS分期相关性

3 讨 论

OPN作为一种分泌型酸性蛋白和细胞的迁移、分化之间密切相关。OPN可通过与某些分子相结合发挥激活一系列细胞信号，促进细胞不断增生，从而导致肿瘤发生；通过与整合素dvB3结合可引起多种蛋白溶解酶合成且分泌到细胞外，进而溶解细胞外基质屏[7]。有研究发现，OPN可能与EMS发生存在密切的联系，在EMS中表达明显升高，与其可促进细胞黏附、浸润以及血管生成等有关[8]。在本研究中OPN在EMS中表达明显高于对照组，且随着分期增加其表达也明显上升，提示OPN可能参与EMS发生、发展过程。在以往研究中有学者通过检测OPN在EMS患者异位组织中的表达情况发现，OPN呈高表达，认为OPN和EMS形成之间存在密切的联系[9]。而本研究也表明OPN与EMS患者r-AFS分期呈正相关，结合以往研究分析，可能与OPN可改变细胞骨架促进细胞黏附与游走有关[10]。此外在患者增生期时OPN表达比分泌期高，说明在增生期更有助于EMS患者子宫内膜异位种植和转移。

TIMP-2主要在EMS患者的血管内皮细胞、腺上皮细胞中分布，在间质细胞中表达较低。在以往研究中显示，基底膜的完整性是判断异位内膜浸润与侵袭的重要标志，TIMP-2在这一过程的调节中具有特殊的意义，可控制细胞外基质的降解合成[11]。在本研究中发现，TIMP-2在EMS患者中表达明显低于对照组，且随着患者病情发展r-AFS分期升高其表达为逐渐降低的趋势，与r-AFS分期呈负相关，在增生期时TIMP-2值明显降低。在以往研究中也发现，在EMS患者异位组织中TIMP-2表达明显降低，而MMPs表达明显增高，两者之间表达失衡，TIMP-2对MMP的作用降低，导致异位内膜中的MMPs水解蛋白活性增加，异位的侵袭与种植能力就会增加，进而导致EMS发生[12]。也有动物研究发现，将人子宫内膜立即注入裸鼠腹腔内，子宫内膜仍可分泌出MMPs，并可在腹腔内种植，但在注射TIMPs后MMPs分泌被抑制，阻碍了异位病灶的发生[13]。以上研究结果说明TIMP-2在患者异位组织中表达降低，无法抑制MMPs，从而促进ESM发展。

STAT3在机体多种细胞及组织中均有表达，磷酸化后可被激活从而进入到细胞核中，并通过与起动因子区域结合来调控靶基因的表达，从而来参与到细胞的生物学行为中。临床中发现STAT3信号通路与细胞分化、增殖及侵袭之间密切相关。在本研究中EMS患者中STAT3表达明显高于对照组，且随着患者分期增加，其表达也明显增加，提示EMS患者中存在STAT3过度活化现象。在以往研究中发现，EMS患者腹腔积液中存在大量促炎性因子，这是激活JAK/STAT3通路的重要刺激因子，也可能是导致EMS患者STAT3过度活化的原因之一[14]。同时也有研究显示，STAT3过度活化可参与子宫内膜的蜕膜化，在女性受孕过程中具有重要的作用[15]。在本研究中患者STAT3在增生期水平高于分泌期，说明STAT3活化异常可能与子宫内膜蜕膜化分化功能异常有关。

综上所述，在EMS患者中OPN、STAT3表达增加、TIMP-2表达下调，三者与患者发生与病情进展间关系密切，监测三者表达情况可为疾病发展预测及转归提供参考。