雷米普利通过激活ERK1/2-Cx43信号通路降低SHR大鼠的血压

赵 亮， 魏 童

(新疆医科大学第五附属医院, 新疆 乌鲁木齐 830011)

高血压是心脏病、脑血管疾病和肾脏疾病最重要的危险因素，严重影响现代人类生活质量[1]。高血压的血管病变(如损伤、氧化应激和炎症)可导致血管收缩压升高[2]。血管紧张素II(Angiotensin,AngII)是一种强大的促炎和血管收缩因子，可诱导平滑肌细胞(SMCs)表型转化并参与血管重塑。雷米普利(ramipril,RMP)是一种关键的血管紧张素的抑制剂，不仅抑制血管紧张素I向血管紧张素Ⅱ的转化，还与内源性缓激肽的积累有关，导致内皮依赖性血管舒张[3]。然而，目前仍缺乏关于RMP对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)血压的影响和调控机制的研究。缝隙连接(gap junction,GJ)是一种典型的存在于相邻细胞之间的膜通道结构，其基本单位称为连接蛋白(connexins,Cxs)。电或化学信号可以通过Cxs从血管内皮细胞进入到血管平滑肌细胞，进一步诱导钙依赖性钾通道的激活，使细胞膜超极化，引起血管舒张。目前已鉴定出21种Cxs，其中Cx43的表达与高血压关系最为密切[4]。在血管平滑肌细胞和血管内皮细胞中，细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)的激活促进Cx43的磷酸化。另外，已知ERK1/2在血管内皮细胞增殖、迁移、分化和细胞周期中发挥重要调控作用，ERK1/2的磷酸化的增加可以介导降压药maximakinin的降压功能，且ERK1/2抑制剂U0126还抑制了Cx43的磷酸化[4]。因此，本课题组推测RMP可改善SHR的血压，其中ERK1/2磷酸化和Cx43磷酸化介导ERK1/2-Cx43信号通路激活有关。因此，本文旨在观察RMP对SHR大鼠血压的作用并探讨其调控机制。

1 材料与方法

1.1试剂与耗材:雷米普利(R0404-250 MG，溶解于生理盐水)购于美国Sigma Aldrich公司。Cx43抑制剂甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)和ERK1/2抑制剂U0126均购于美Sigma Aldrich公司。苏木精伊红染色试剂盒及BCA蛋白浓度检测试剂盒购于上海碧云天公司。聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜购于美国Millipore公司；脱脂奶粉购于美国BD公司。单克隆鼠抗GAPDH 抗体(TA-08)购于北京冷杉金桥生物科技有限公司；多克隆兔抗Cx43，ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗体均购于美国Abcam公司，单克隆兔抗磷酸化Cx43抗体p-Cx43(Ser368)购于美国CST公司。二抗购于北京金桥生物科技有限公司稀释剂；ECL化学发光试剂购于英国GE健保与生命科学公司。

1.2实验动物:50只成年雄性SHR大鼠(10周龄，300～350g)和10只健康成年雄性wistar大鼠(10周龄，300～350g)购于新疆医科大学实验动物中心。实验大鼠在白天/黑夜交替(12h/12h)的24℃室温条件下饲养，并提供饮水和食物供自由摄取。本研究的所有动物实验均经过我院动物伦理委员会审查通过。研究中所有动物实验操作均按照美国国立卫生研究院(National Institutes Of Health,NIH)出版的《实验室动物护理和使用指南》(出版物第85-23号，1996年)进行。

1.3动物给药和分组:50只成年雄性SHR大鼠(300～350g)和10只健康成年雄性wistar大鼠(300～350g)购于新疆医科大学实验动物中心。实验大鼠在白天/黑夜交替(12h/12h)的24℃室温条件下饲养，并提供饮水和食物供自由摄取。SHR大鼠随机数字表法分为SHR组、RMP+SHR组、RMP+甘珀酸[CBX，缝隙连接蛋白43(Cx43)抑制剂]+SHR组、RMP+CBX+U0126[细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)抑制剂)]+SHR组，n=10/组。健康wistar大鼠为control组(n=10)并与SHR组均给予生理盐水40mL/kg i.v.，其余3组分别给予RMP 10mg/kg i.v.，RMP 10 mg/kg和CBX 13.5mg/kg i.v.，RMP 10 mg/kg和CBX 13.5mg/kg和U012612 mg/kg i.v.，尾静脉推注。

1.4大鼠动脉收缩压检测:Control组、SHR组、RMP+SHR组、RMP+CBX+SHR组、RMP+CBX+U0126+SHR组的所有大鼠在给药48h后，采用BP-6大鼠无创血压测试仪读取大鼠动脉收缩压数值。

1.5大鼠脑组织分离:Control组、SHR组、RMP+SHR组、RMP+CBX+SHR组、RMP+U0126+SHR组、RMP+CBX+U0126+SHR组的大鼠接受戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射，麻醉后迅速处死动物。用钩镊固定大鼠颅骨，用组织剪分离颅骨和颈椎连接，剪开头部皮肤，掀开颅骨暴露完整的脑组织，收集脑组织标本，将脑组织用冷生理盐水清洗。分离颅底动脉，保存于4℃。

1.6大鼠颅底动脉(直径<400μm)病理观察:分离Control组、SHR组、RMP+SHR组、RMP+CBX+SHR组、RMP+U0126+SHR组、RMP+CBX+U0126+SHR组的的颅底动脉组织后。用含10%福尔马林的磷酸盐缓冲液(pH7.4)固定颅底动脉。将固定基底动脉脱水，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，经二甲苯I(10 min)和二甲苯II(15 min)脱蜡，再经过乙醇[无水乙醇I(5 min)、无水乙醇II(5 min)、95%乙醇(2 min)、90%乙醇(2 min)、80%乙醇(2 min)、70%乙醇(2 min)]水化，用蒸馏水洗去乙醇。清洗后切片按试剂盒提供的说明书进行苏木精伊红(H&E)染色。乙醇脱水分化后，用BX50光学显微镜进行观察。每个切片取自6个不同区域(200倍放大)，测量动脉血管厚度变化。

1.7Western blot:采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测Control组、SHR组、RMP+SHR组、RMP+CBX+SHR组、RMP+U0126+SHR组、RMP+CBX+U0126+SHR组的颅底动脉组织中蛋白的浓度。随后均匀煮沸10min进行蛋白变性。将变性后的总蛋白用10%分离凝胶进行电泳，电泳完成后转移至膜。将PVDF膜加入到含有50g/L脱脂奶粉的堵液中，将其置于室温下的摇床上2h，然后在添加相应的一抗GAPDH(1∶1000)，Cx43(1∶1000)，p-Cx43(Ser368)(1∶5000)，ERK1/2(1∶1000)，p-ERK1/2(1∶1000)，第2天，PVDF膜在4℃摇床上孵育2h，然后加入相应的二抗(1∶5000)稀释剂，用1×TBST洗涤3次(10min/次)。添加发光试剂到暗室中进行曝光，并在清洗后留下来进行显影。使用Quantity One(Bio-Rad)评估每个目标蛋白条带的光密度，GAPDH为内参蛋白。

2 结 果

2.1RMP的降血压作用:SHR组大鼠呈高血压症状，与Control组比，SHR组的收缩压从118.25±12.33上调至178.63±12.64，差异具有统计学意义(均P<0.05)，与SHR组比，RMP+SHR组大鼠血压降低了近30%(均P<0.05)。见图1。

图1 RMP对SHR大鼠的降压作用

2.2RMP改善SHR大鼠脑动脉壁厚度变化:苏木精-伊红染色形态学分析了大鼠脑动脉壁的变化。与Control组比，SHR组大鼠脑动脉肥大，并表现为壁厚、管腔直径、中膜厚度和管腔横截面面积增加；与SHR组比，RMP+SHR组大鼠上述形态学变化明显减轻。见图2。

图2 RMP改善SHR大鼠脑动脉壁厚度的影响

2.3RMP激活SHR大鼠体内ERK1/2-Cx43信号通路:观察ERK1/2-Cx43信号通路蛋白的表达，SHR组p-ERK1/2和p-Cx43的水平都较Control组明显降低，而ERK1/2和Cx43的表达差异不明显(P<0.05)同样与SHR组比，RMP+SHR组的ERK1/2和Cx43的表达差异不明显(P<0.05)，但是p-ERK1/2和p-Cx43表达水平均上调，差异有统计学意义(P<0.05)。表明RMP可激活SHR大鼠体内ERK1/2-Cx43信号通路。见图3。

图3 Western blot检测ERK1/2-Cx43信号通路信号蛋白的表达变化

2.4CBX联合U0126抑制ERK1/2-Cx43信号通路的激活:与RMP+SHR组比，RMP+CBX+SHR组p-Cx43表达降低(均P<0.05)，p-ERK1/2的表达无明显变化(P>0.05)，但RMP+U0126+SHR组p-Cx43和p-ERK1/2的表达都降低(均P<0.05)。另外，与RMP+CBX+SHR组或RMP+U0126+SHR组比，RMP+CBX+U0126+SHR组的p-Cx43和p-ERK1/2的表达都降低(均P<0.05)。见图4。

图4 Western blot检测ERK1/2-Cx43信号通路信号蛋白的表达变化

2.5阻断ERK1/2-Cx43信号通路促进血压升高和脑动脉壁增厚:与RMP+SHR组比，RMP+CBX+SHR组和RMP+U0126+SHR组的血压明显增高(图5，均P<0.05)，大鼠脑动脉壁增厚严重，表现为壁厚、管腔直径、中膜厚度和管腔横截面面积增加，差异有统计学意义(图6，均P<0.05)。与RMP+CBX+SHR组或RMP+U0126+SHR组比，RMP+CBX+U0126+SHR组的血压增加(图5，均P<0.05)，脑动脉壁厚增加(图6，均P<0.05)。

图5 阻断ERK1/2-Cx43信号通路促进血压升高

图6 阻断ERK1/2-Cx43信号通路增加大鼠脑动脉壁厚度。H&E染色图(200X)。#，与SHR比，P<0.05。&，与RMP+SHR比，P<0.05。$，与RMP+CBX+SHR/RMP+U0126+SHR比，P<0.05。SHR：自发性高血压大鼠；RMP：雷米普利。CBX：Cx43抑制剂；U0126：ERK1/2抑制剂。

3 讨 论

本文研究果表明：①RMP存在下明显减弱了SHR动脉血管壁厚度，从而缓解了血管腔狭窄。②RMP调控的这些病理变化与动物体内Cx43的以及ERK1/2的失活相关，而这些病理变化可被Cx43以及ERK1/2的抑制剂CBX和U0126逆转。

在高血压中，机械压力和血流对血管壁的影响会破坏血管内皮，从而增加内皮的通透性。单核细胞、淋巴细胞和中膜平滑肌细胞进入内膜，正常血管结构消失，从而促使动脉血管重构的发生，严重引发栓塞[5,6]。血管紧张素Ⅱ作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统的重要组成部分，参与了高血压的发生发展。下调血浆血管紧张素Ⅱ水平可延迟或逆转血管重构，改善血管舒缩功能，改善血管顺应性。在动脉重构过程中，血管同步收缩反应受到影响，从而改变血管舒缩功能[7]。RMP作为血管紧张素的抑制剂，不仅抑制血管紧张素I向血管紧张素Ⅱ的转化，还与内源性缓激肽的积累有关，导致内皮依赖性血管舒张。例如，RMP可通过抑制血管紧张素转化酶从而促进内皮B2激肽受体相关NO的释放促进血管舒张，另外，RMP可以通过调控血紧张素转化酶，并阻断血管紧张素I向血管紧张素Ⅱ转化的同时增加血管紧张素(1-7)，从而能减少缓激肽的降解，而血管紧张素(1-7)和缓激肽可协同促进血管舒张[7,8]。本研究观察到RMP治疗SHR后，血压明显降低，而动脉血管壁厚度同样随着RMP的治疗而明显减少。然而，这些变化背后的分子机制尚不清楚。

研究表明Cx43的水平与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的表型密切相关，细胞因子诱导VSMC收缩表型的转变与VSMC细胞中Cx43表达的增加有关[9]。VSMC的胞外信号的激活ERK1/2可以促进Cx43的磷酸化，而p-Cx43含量的增加则促进内皮细胞的电信号或化学信号传递并进一步调节血管张力，扩张血管，降低血压，添加ERK1/2的抑制剂U0126能有效地阻断p-Cx43的激活和相应的降压效应[4]。另外，Cx43过表达能促进VSMC的增殖和迁移，而且Cx43表达减少(siRNA-Cx43)则可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的细胞增殖和迁移[3]。一致的是，本研究结果首先观察到高血压动物模型中p-ERK1/2和p-Cx43表达均降低，而RMP治疗后p-ERK1/2和p-Cx43的表达明显增加，提示ERK1/2和Cx43被激活，而U0126和CBX都可以显著下调p-Cx43的表达(CBX不影响p-ERK1/2的的表达)从而逆转了RMP对高血压和动脉血管壁增厚的抑制效果。本研究结果提示RMP通过上游ERK1/2磷酸化激活Cx43，激活Cx43进一步促进血管舒张，降低血压。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是血管紧张素Ⅱ重要的下游靶点，MAPK通路是Cx43相关功能的关键调控通路，其中ERK1/2的磷酸化可以激活Cx43[10]。越来越多的研究报道ERK1/2信号与动脉血管的重塑和血管壁厚度密切相关[11]。本研究表明，ERK1/2信号可以被RMP激活，与此同时，利用组织学染色观察到动脉壁厚度明显减少，而ERK1/2的抑制剂U0126明显增加了厚动脉壁的厚度，降低了Cx43 Ser368位点的磷酸化水平。表明RMP通过调控ERK1/2信号通路及下游的Cx43磷酸化从而调节大脑动脉高血压和管壁厚度。GJs允许小代谢物和信号分子(如环磷酸腺苷和Ca2+)在连接的细胞之间进行穿梭，而不进入细胞外空间[11]。因此，当这些连接的细胞中的一些接收到信号时，整个细胞群都会做出反应。大脑动脉细胞之间的GJs连接通过影响细胞分化、迁移和存活在大脑发育中发挥作用[12]。研究表明，在高血压期间，Cx43不仅在细胞间通讯中发挥重要作用，还能促进血管收缩，增加血管顺应性，最终导致动脉重构[13,14]。不仅如此，本研究的结果发现在SHR中Cx43是一个受多级信号调控的蛋白分子，通过ERK信号转导通路介导的Ser368位点磷酸化，表明Cx43在RMP改善的高血压和动脉血管壁增厚中扮演重要角色。然而，仍需要更多的体外和体内高血压模型来验证ERK1/2-Cx43信号介导的SHR维持高血压的机制，以及使用类似有RMP作用的药物激活ERK1/2-Cx43通路的可能的抗高血压作用。

总之，本研究结果表明，注射RMP降低SHR的血压和动脉血管壁厚度，激活ERK1/2-Cx43通路。此外，用U0126抑制了ERK1/2-Cx43信号后明显减弱了SHR的效果。表明RMP可能具有高血压治疗潜力，进一步研究靶向ERK1/2-Cx43信号的药物对于减轻高血压具有重要意义。