早产儿B303 亚型鉴定及家系调查分析

徐子恒，王莲慧，万贝妮，徐秀云，刘昕

（江西省儿童医院输血科，江西 南昌 330006）

ABO 血型系统是最具临床意义的血型系统之一，该系统除了A、B、AB、O 四种表型外，还存在一些罕见且有特殊意义的ABO 亚型[1-2]。 常规血清学试验方法易造成ABO 亚型的漏检或误判， 从而给临床输血工作带来极大的安全隐患。 临床上，因基因变异使红细胞上B 抗原数量较正常减弱的特异性的血型称为B 亚型， 依据血清学的不同特征，B亚型分为B3、Bx、Bm、Bel、Bend，以及弱表型的Bw亚型[3]。 目前，已经检测出的B 亚型基因有48 个（根据国际输血协会ISBT 统计，截止于2017 年10月23 日，之后系统未再更新），仅B3 亚型等位基因就有13 种[4-5]。 在婴幼儿、新生儿、早产儿群体中， 由于免疫系统发育不完善存在生理性的红细胞表面抗原表达偏弱， 通常常规血清学方法难以准确鉴定亚型[6-8]。 随着基因检测技术在输血领域的应用，越来越多的ABO 疑难血型得到准确鉴定。现就我院在早产儿群体中发现的1 例罕见B303亚型的血型鉴定分析过程报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例资料 患儿，女，22 d，孕29+5 周出生早产儿，G5P3， 2021 年8 月因黄疸十余天入我院，到我科进行新生儿溶血病项目的检测。 血型检测时发现正定型B 抗原减弱（1+W），怀疑血型为ABO 亚型，进一步进行血型基因检测分析。 同时在征得其家属知情同意的情况下采集患儿父亲、 母亲的血液标本备查。

1.2 试剂与仪器 抗-A、抗-B、抗-H 试剂和ABO标准红细胞来自上海血液生物医药责任有限公司(批 号 分 别 为20210615、201210615、20210114 和20205335), ABO 血型鉴定微柱凝胶卡由长春博迅生物有限公司提供（批号20200910），基因组DNA提取试剂盒为天根公司产品(批号S7114), ABO-B基因分型试剂盒为天津秀鹏公司提供 (批号K202101001)，所有试剂均在有效期内使用。血型专用离心机(日本久保田公司KA-2200 型)、高速离心机(德国Eppendorf5430 型)、血型血清学用离心机(TD-3A 型， 长春博研科学仪器公司)、PCR 扩增仪(Bio-Rad C1000 型)、 凝胶成像系统 (美国伯乐Bio-Rad GelDocXR+型）, 电泳仪 (六一仪器厂DYY-8C 型)。

1.3 方法

1.3.1 ABO 血型血清学试验 患儿血型鉴定采用盐水法和微柱凝胶卡法， 所有试验均严格按照操作规范及生产厂家使用说明书进行操作和结果判读。

1.3.2 血标本DNA 提取 参照天根公司试剂盒说明书提取血液标本DNA。

1.3.3 PCR-SSP 法ABO-B 亚型基因分型检测调 整DNA 浓 度 范 围30~50 ng/μL，A260/A280 为1.6~1.8，PCR 扩增反应按说明书设置，PCR 产物经2.5%琼脂糖凝胺电泳后在凝胶成像系统下分析,按说明书 判读结果并记录。

2 结果

2.1 ABO 血型正反定型结果 室温条件下ABO 血型正定型B 抗原极弱，易误判为O 型，多次离心后发现正定型B 抗原出现弱凝集(抗B:1+w)，反定型为O 型(Ac：3＋，Bc：1+)。 患儿血型初步判断为B 亚型， 其父、 母亲血型血清学结果分别为AB3 和O型。 见表1。

表1 先证者及其父母血型血清学反应格局

2.2 PCR-SSP B 亚型基因检测结果 该儿童基因型通过ABO-B 亚型基因分型检测, 琼脂糖凝胶电泳结果提示该儿童血型基因型为B303/O 型，根据血清学检测结果分析此亚型来源于父亲的可能性大， 对父亲的DNA 标本进行B 亚型基因检测，提示其父亲的血型基因型为A/B303。

3 讨论

ABO 基因位于人类第9 号染色体（9q34），ABO 亚型的形成与其第6、7 号外显子的突变密切相关。 亚型形成的分子机制包括单核苷酸多态性(SNP)、碱基缺失或插入、启动子区域CpG 甲基化、基因重组和杂交基因、剪接位点突变等[9-12]。目前基因分型检测、 基因测序等基因检测技术已经广泛用于ABO 亚型的辅助鉴定[7，9]。

B 亚型在我国并不少见，根据国内文献报道B亚型较A 亚型更为常见[13]。 而B3 亚型是B 亚型中最为罕见的一种， B3 亚型具有明显的家系遗传特点，因红细胞上B 抗原位点数稀少[14]导致部分红细胞与抗-B 抗体不发生凝集， 在临床上常因正定型出现“混合视野凝集”或“双群”现象而被发现[15]，婴幼儿、 特别是早产儿因自身红细胞抗原发育不完全，亦或疾病等原因，造成红细胞表面抗原表达不完全， 血型正反定型时易被漏检或误判。 本研究中， 先证者为出生22 d 的早产儿，ABO 血型血清学结果显示正定型（微柱凝胶法）检出很弱的B 抗原， 试管法患儿红细胞与抗B 血清室温下立即离心为阴性，多次离心逐渐出现2+混合凝集，推测因患儿低龄且早产的原因，因此未出现典型“双群”现象。 反定型检测到正常的抗-A 抗体（3+）和弱B抗体（1+） ，H 抗原相应增强（4+w），同时血清中检测到含有抗-B 抗体， 但不能排外体内含有来自母亲的抗B 抗体干扰，仅初步怀疑为B 亚型，体现出血清学检测ABO 亚型的局限之处。遂进行ABO-B亚型基因分型， 证实患儿血型基因型为B303/O型，其父亲血型基因型为A/B303，符合遗传规律。该病例因缺少样本无法继续做测序确认， 待患儿满1 周岁后随访调研。

B303 亚型的特征性突变为ABO 基因第3 内含子IVS3+5G > A 的突变， 与常见的第6、7 外显子突变位点不同， 基因测序时如果未覆盖内含子编码区域将会导致B3 亚型漏检，这可能是导致临床上B3 亚型被较少发现的原因之一。 IVS3+5G >A 的突变导致ABO 基因的保守序列被破坏， 蛋白质转录过程异常，最终导致α-1，3-D-半乳糖基转移酶（GTB 酶）的部分氨基酸缺失[16-17]，GTB 酶活性或结构上发生特异性改变， 从而导致B 抗原表达减弱以及混合凝集视野的B3 亚型出现[18-19]。

本研究中该早产儿在进行血型复核时发现与初查血型不一致， 在初查血型时将其ABO 血型正定型误判为O 型， 该患儿标本送我科进行溶血病检测时用其他厂家的微柱凝胶卡检测发现存在B抗原。因此，我们建议临床上涉及患者ABO 血型初查与复查时应使用不同品牌试剂（或微柱凝胶卡）进行检测，特别是新生儿群体因抗原发育不完全、来自母体的抗体干扰等因素， 给血型的准确鉴定带来困扰。 ABO 血型亚型的鉴定需要结合血清学实验的特性， 联合应用分子生物学技术进行综合判断[11，20-22]。 本研究中患儿血清中含有抗-B 抗体，若输入正常AB 型或B 型血液易发生输血反应。该早产儿输血时应选择O 型洗涤红细胞配合型输注， 选择B 型或O 型悬浮红细胞输注将影响输血治疗效果。

综上所述，随着临床用血量的日益增加，伴随的ABO 亚型输血者也越来越多。新生儿、早产儿等特殊群体因生理发育的特殊性， 临床上仅靠血清学方法很难发现ABO 亚型。 我们建议针对6 月龄以内的婴幼儿也应开展ABO 血型正反鉴定， 正定型明显偏弱（<3+），反定型有/无抗体时，均应考虑通过基因分型等分子生物学手段， 结合血清学试验来结合判断ABO 血型以准确定型， 为临床输血安全提供重要保障。