白花蛇舌草总黄酮对多药耐药白血病CEM/VCR细胞增殖凋亡的影响

饶丽华，章国良，席启辉，赵诗云

（1.江西省中西医结合医院检验科，江西 南昌 330003；2.解放军908 医院感染科，江西 南昌 330002；3.江西省中医药研究院，江西 南昌 330008）

白花蛇舌草是属于茜草科下的一种草本植物，在医学领域通常是指白花蛇舌草的全草，此外这种植物还有龙舌草、蛇针草等名字[1]。 这种植物一般生长在我国南方各个地区， 在夏秋两季成熟后采摘入药。 白花蛇舌草最早被记载在 《新修本草》，并被称为“蛇舌”，中医认为白花蛇舌草在使用中具有清热解毒、利尿消毒的效果[2]。 目前已经证实白花蛇舌草的乙酸乙酯提取物可通过阻断细胞周期至G0/G1 期诱导HepG2 细胞凋亡[3]，还有报道白花蛇舌草的提取物还可通过活化Hippo-YAP信号通路抑制胰腺癌SW1990 细胞EMT 的发生[4]，对乳腺癌也有一定的抗肿瘤作用[5]。 但是针对多药耐药白血病CEM/VCR 细胞的增殖凋亡还没有进行过深入的研究。 本文通过观察白血病CEM/VCR细胞在白花蛇舌草总黄酮溶液中的表现， 探究白花蛇舌草抑制CEM/VCR 细胞的生长作用以及诱导凋亡作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 白花蛇舌草（江西青春康源中药饮片有限公司， 批号：20171101）； 噻唑蓝、 二甲基亚砜（Sigma 公司）；小牛血清（杭州四季青）；RPMI1640（Gibco 公司）；淋巴细胞性白血病CEM 细胞株；白血病CEM 细胞； 凋亡检测试剂盒 （北京保赛生物）；青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 培养细胞的培养基是加入了双抗并且小牛血清体积分数为10%的RPMI1640，并且放置于5% CO2、湿度饱和且温度恒定为37℃的培养箱中。

1.2.2 白花蛇舌草总黄酮溶液制备 江西省中医药研究院中药药理研究所完成白花蛇舌草总黄酮提取：白花蛇舌草水提取液（1∶1），上处理好的大孔吸附树脂，先用水洗脱，弃水洗液，再用20%乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用50%乙醇洗脱，弃去洗脱液，最后用70%乙醇洗脱，得洗脱液，挥去乙醇，浓缩至1∶1 得白花蛇舌草总黄酮（1 g 生药/mL），备用。使用时干燥后称质量， 制成220 mg/mL 水的白花蛇舌草总黄酮溶液。

1.2.3 MTT 比色实验 取出培养的CEM/VCR 细胞并进行离心速度为1500 r/min、时长为8 min 的悬液离心操作， 并对细胞计数后将细胞悬液浓度调整为3×105/mL，随后将细胞悬液在96 孔（每孔190 μL）培养板上进行接种，比色实验设置实验组、对照组、 空白组三组， 实验组分别加入浓度为0.00512、0.0256、0.128、0.64、3.2、16 μg/mL 的 白 花蛇舌草总黄酮溶液，对照组（细胞+生理盐水），空白组（黄酮+培养基），培养于三个时间段（每24 小时一段）后，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，在4 h后以1 500 r/min 的转速将细胞离心8 min，随后将上清液抛弃，并加入DMSO 150 μL，当甲臜完全溶解后放置于自动酶标仪，测量吸光度（A490）值，并计算抑制率。

1.2.4 形态学观察 与MTT 比色实验基础操作相同取得实验组和对照组溶液， 并在显微镜下观察两组细胞并拍照；将CEM/VCR 细胞悬液离心后制作为涂片， 在使用Giemsa 染色后放置于油镜下观察； 将分别加入了浓度为0.0256 μg/mL，0.128 μg/mL 以及0.64 μg/mL 的白花蛇舌草总黄酮溶液的CEM/VCR 细胞在24 h 及48 h 两个时间段后制作为超薄切片鋨酸染色，并放置于透视电镜下观察。

1.2.5 流式细胞计量术分析 将分别加入了浓度为0.0256 μg/mL，0.128 μg/mL 以及0.64 μg/mL 的白花蛇舌草总黄酮溶液的CEM/VCR 细胞在24 h 及48 h 两个时间段后，使用PBS 洗两遍，并用70%乙醇固定， 将细胞悬液浓度调整为1×106/mL 并重悬在PBS 中，取100 μL 细胞悬液并加入1 mL 的PI，轻轻摇晃使两者混合均匀后放置与4℃的冰箱中0.5 h，随后通过流式细胞仪进行检测。

1.3 统计学方法 本研究通过双侧t 检验， 并求P值，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白花蛇舌草对白血病CEM/VCR 的抑制作用由MTT 比色实验实验结果可以得出， 白花蛇舌草对CEM/VCR 细胞的生长有着明显的抑制作用，并且抑制效果与白花蛇舌草总黄酮溶液的浓度以及时间都有密切的关系。 当药物浓度在0.00512 μg/mL 时开始起效， 对CEM/VCR 细胞半数抑制浓度在0.128 μg/mL 左右，见表1。

表1 白花蛇舌草总黄酮对CEM/VCR 细胞生长的影响（±s）

表1 白花蛇舌草总黄酮对CEM/VCR 细胞生长的影响（±s）

注：与对照组相比，△P<0.05,*P<0.01；n=6。

组别24 h A490 48 h 72 h 24 h抑制率（%）48 h 72 h对照空白0.00512 μg/mL 0.0256 μg/mL 0.128 μg/mL 0.64 μg/mL 3.2 μg/mL 16 μg/mL 1.038±0.075 0.105±0.013 0.846±0.054△0.742±0.058*0.668±0.051*0.589±0.028*0.559±0.042*0.514±0.035*1.175±0.211 0.096±0.008 0.923±0.112 0.803±0.066△0.633±0.038*0.548±0.052*0.524±0.042*0.497±0.054*1.298±0.124 0.094±0.018 0.954±0.075*0.784±0.094*0.633±0.038*0.547±0.041*0.518±0.036*0.456±0.029*19.60 30.53 38.72 45.93 50.26 56.54 24.32 34.95 51.19 57.88 61.51 63.98 31.41 42.52 55.76 62.38 63.80 69.71

2.2 细胞形态学变化

2.2.1 光镜 对照组未加入白花蛇舌草总黄酮溶液的CEM/VCR 细胞在光镜下表现为均匀饱满，并且存在侧凸，见图1。 实验组加入白花蛇舌草溶液后细胞数量明显减少，并且细胞体积大小不均一，有明显的缩小，见图2~3，在高浓度的白花蛇舌草总黄酮溶液中出现了细胞破裂的情况，见图4。 在油镜下观察染色涂片，其中对照组中细胞呈现球状，体积均匀，具有较大的细胞核并且核浆比例异常，见图5。 实验组细胞体积缩小，见图6，大小不均衡，细胞膜出现皱缩，看不清楚细胞内部结构，染色质呈现疏松粗糙的状态，并且细胞核着色较深，核浆比同样异常，见图7；此外能够见到许多细胞染色质凝集边聚成凋亡小体，见图8。

图2 在0.128 μg/mL 药物浓度下CEM/VCR 细胞48 h 后细胞形态（200×）

图4 在16 μg/mL药物浓度下48 h 后细胞形态（200×）

图5 对照组CEM/VCR细胞形态（1000×）

图6 在0.128 μg/mL 药物浓度下CEM/VC 细胞24 h后的细胞形态(1000×)

图7 在0.128 μg/mL 药物浓度下CEM/VCR 细胞48 h后的细胞形态（1000×）

图8 在0.64 μg/mL 药物浓度下CEM/VCR 细胞48 h后的细胞形态（1000×）

2.2.2 电镜 对照组细胞在电镜下表现为圆形以及椭圆形， 能够清除看到大核仁的肾形细胞核其常染色质，胞浆内各个结构丰富清晰，在细胞膜上能够观察到微绒毛和伪足突起，见图9。 对照组细胞在电镜下能够明显观察到体积缩小， 出现早期细胞凋亡等现象，例如核碎片等，见图10；部分细胞核膜消失，并且出现大的团块，细胞结构已经无法观察到，见图11。 并且随着时间的增加，药物浓度的提高，观察到细胞凋亡的现象越来越多，并且能够观察到新月形核的凋亡细胞，见图12。

图1 正常CEM/VCR细胞形态（200×）

图9 对照组CEM/VCR细胞超微结构（4000×）

图10 在0.0256 μg/mL 药物浓度下CEM/VCR 细胞48 h 后细胞超微结构（4000×）

图11 在0.128 μg/mL 药物浓度下CEM/VCR 细胞48 h后细胞超微结构（5000×）

图12 在0.64 μg/mL 药物浓度下CEM/VCR 细胞48 h后细胞超微结构（5000×）

2.3 细胞凋亡率 按照流式细胞仪检测结果显示，随着药物浓度的提升以及时间的增长，CEM 细胞的凋亡率随之增加，见表2。

表2 CEM 细胞凋亡率

图3 在0.64 μg/mL药物浓度下48 h 后细胞形态（200×）

3 讨论

白血病是一种由于人体内部造血干细胞克隆出现失控的疾病，属于造血系统中的恶性肿瘤。 目前白血病多发于青少年， 是在中青年群体中发病率、致死率最高的癌症[6]。 其发病的主要机理是由于白细胞的增殖以及分化出现异常， 不能够按照正常程序进行凋亡， 使细胞停滞在各个不同的发育阶段， 患者的骨髓以及其他造血组织会被大量失控的白细胞填充， 影响人体正常造血的进程[7]。随着联合化疗、造血干细胞移植、免疫治疗、中医治疗等开展应用， 已开始能够有效提高患者的存活率以及生活质量，这是一个不争的事实。 目前主要以药物、 化疗以及骨髓移植这三个方向对患者进行治疗，但是这些方法还存在问题和缺陷。 药物治疗虽能缓解症状，但是对患者的毒副作用很大，会使患者在临床上出现感染、出血的症状；化疗不仅会杀伤癌细胞，同时还会对正常细胞进行灭杀；骨髓移植则存在费用高、 成功率低以及配型成功率低等问题[8]。 细胞凋亡的概念提出来以后，人们可以使用药物使细胞增殖速度小于凋亡速度来控制白血病细胞的生长， 因此细胞凋亡率就成为了评价白血病治疗效果的一项指标[9]。

本研究利用不同浓度的白花蛇舌草溶液加入到CEM/VCR 细胞中， 通过MTT 比色实验我们发现CEM/VCR 细胞的增殖生长明显收到白花蛇舌草的抑制， 并且抑制效果会随着时间和剂量的增加而增加； 在光镜观察实验组和对照组两组的CEM/VCR 细胞， 发现实验组细胞的体积相对缩小，细胞的数量明显减少，并出现核浓染；电镜下显示实验组细胞的形态学呈现出典型的凋亡特性； 由流式细胞计量术能够计算得出随着药物浓度的提升以及时间的增长，CEM/VCR 细胞的凋亡率随之增加，说明白花蛇舌草能够诱导CEM/VCR细胞凋亡。

综上所述白花蛇舌草对CEM/VCR 细胞有明显的抑制作用， 并且能够诱导CEM/VCR 细胞凋亡，在抗白血病的治疗中有重要作用。 但是其作用机理尚不十分明了，但有学者认为miRNA-326 和N-ras 基因的检测可作为儿童ALL 的诊断及复发生物学标志,也可为白血病的耐药性监测和治疗提供新的靶点[10]；还有学者认为[11]CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞可能通过细胞凋亡信号通路影响急性白血病的发展。 关于其机制有待进一步的研究。