基于网络药理学的胆黄润肠丸治疗慢传输型便秘作用机制研究※

金 莹 居 羚 黄 玮 杨洪元 高素琴

慢传输型便秘（slow transit constipation,STC）约占便秘的16%～40%，是功能性便秘的常见类型，多见于老年人和女性患者[1]。随着社会人口的老龄化，饮食结构的改变以及精神心理和社会因素的影响[2]，STC发病率呈上升趋势。由于STC病因复杂多样，临床症状顽固，西医对症、手术治疗效果欠佳[3]。中医治疗便秘历史悠久，经验丰富。便秘之症始见于《黄帝内经》，称之为“后不利”“大便难”。相关研究[4]发现，STC的中医证型以气虚肠燥证、气阴两虚证和脾肾阳虚证为主，对STC的中医治疗具有指导意义。现代中医临床治疗STC 多以通下为主，并辅以生津润肠、益气健脾等药进行综合调理[5]。国内一些学者采用双盲、随机、安慰剂对照法对中药治疗STC的疗效和安全性进行了验证，并得到了国际业内人士的肯定[6-8]。

胆黄润肠丸（苏药制字Z04001225）由大黄和猪胆膏两味中药组成，为江苏省常州市中医医院全国名老中医周玉祥教授遵循“六腑以通为用”“六腑以通为补”的治则而拟的临证经验方，具有润肠通便、清热解毒的功效，临床适用于痔疮手术及便秘等病症，对老年功能性便秘效果尤佳[9]。该院内制剂已有50 余年的创方史及临床应用基础，因处方组成精练、制剂工艺简易、患者服用方便，有着良好的临床疗效和应用前景。江苏省常州市中医医院前期虽对该特色制剂开展了一系列的临床疗效观察、质量标准提高和药理实验等研究工作[10-16]，但获得的信息较为片面，无法系统全面地阐明胆黄润肠丸的作用机制。本研究采用网络药理学方法，对胆黄润肠丸所含药物的多成分、多靶点和疾病之间复杂的网络关系进行研究，为揭示胆黄润肠丸治疗STC的作用机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 胆黄润肠丸活性成分的筛选用关键词“大黄”检索中药系统药理数据库和分析平台TCMSP（https://tcmsp-e.com），以口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18作为大黄活性成分的筛选标准[17]，采集大黄活性成分的基本属性信息，点击活性成分结构式获得mol2文件备用。在中国知网CNKI（https://www.cnki.net）检索猪胆粉相关文献[18-19]获得主要成分化学名，利用有机小分子生物活性数据库PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）确定猪胆粉主要成分的结构式及基本参数，依据Lipinski五规则[20]：分子量（MW）＜500、氢键给体数目（Hdon）＜5、氢键受体数目（Hacc）＜10、脂水分配系数（AlogP）＜5、可旋转键的数量（RBN）＜10筛选出猪胆粉的活性成分，并下载有效化合物的sdf 文件备用。

1.2 胆黄润肠丸活性成分潜在靶点预测汇总大黄活性成分的mol 2文件与猪胆粉活性成分的sdf文件，借助药效团匹配与潜在识别靶标平台PharmMapper（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）预测胆黄润肠丸活性成分的潜在靶点。靶标选择“Human Protein Targets Only”，获取大黄与猪胆粉活性成分的csv文件后，以Norm Fit＞0.9作为有效靶点的筛选条件，并通过蛋白质数据库Uniprot（https://www.uniprot.org)进一步规范靶点基因名，将其校正为官方名。

1.3 构建胆黄润肠丸“药物-活性成分-靶点”网络将大黄和猪胆粉有效靶点的基因信息整理为胆黄润肠丸的network文件和type文件，利用生物信息分析软件Cytoscape 3.7.1 构建胆黄润肠丸的“药物-活性成分-靶点”网络。根据节点度值（Degree）调整图标尺寸和颜色深浅，并将活性成分节点按度值大小顺序排列。

1.4 慢传输型便秘关联靶点与“药物-疾病”交集靶点筛选用关键词“slow transit constipation”检索在线《人类孟德尔遗传》数据库OMIM（https://omim.org）和人类基因综合数据库Genecards（https://www.genecards.org），两库筛选得到的靶点进一步整合去重即为STC 的关联靶点。将胆黄润肠丸和慢传输型便秘关联靶点上传在线平台Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），获得“药物-疾病”交集靶点及韦恩图。

1.5 构建“化合物-疾病”交集靶点互作网络（PPI）应用蛋白互作数据库STRING（https://www.string-db.org）构建交集靶点的互作网络（PPI），“Multiple proteins”菜单栏输入“药物-疾病”交集靶点列表，“Organism”项选择“Homo sapiens”，“medium confidence”设置为0.4，获得“化合物-疾病”交集靶点PPI。将下载的tsv 文件导入Cytoscape 3.7.1 软件，根据靶点相互作用的度值重新布局“化合物-疾病”交集靶点互作网络。

1.6 GO 和KEGG 通路富集分析应用Metascape（https://www.metascape.org）数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）的富集分析，输入“药物-疾病”交集靶点列表，“Input as species”选择“H.sapiens”，点击“Custom Analysis”进入Enrichment 菜单页，“P Value Cutoff”设置为0.01，分别对KEGG 和GO 进行富集分析。“Analysis Report Page”页截取GO 通路信息，借助生信结果作图网站微生信（http://www.bioinformatics.com.cn）制作GO 富集BP、MF、CC三合一柱状图，以及KEGG富集气泡图。

2 结果与分析

2.1 胆黄润肠丸活性成分筛选结果TCMSP数据库共检索到大黄成分92个，以OB≥30%、DL≥0.18为筛选标准，获得大黄活性成分16 个，详见表1。因TCMSP数据库尚未收载猪胆粉品种信息，故采用自主建库模式筛选该中药的活性成分。检索文献发现，猪胆粉含有结合型胆酸、游离型胆酸、胆色素和氨基酸等19种主要成分。依据Lipinski五规则筛选PubChem数据库内猪胆粉成分基本参数，共获得猪胆粉活性成分8个，详见表2。

表1 大黄有效化合物基本信息表

表2 猪胆粉有效化合物基本信息表

2.2 胆黄润肠丸活性成分靶点预测结果以Norm Fit＞0.9 为筛选标准，借助PharmMapper 平台共得到大黄潜在靶点421 个、猪胆粉潜在靶点189 个。通过蛋白质数据库Uniprot 的Retrieve/ID mapping 功能进一步规范潜在靶点的基因名，去重后最终获得胆黄润肠丸活性成分潜在靶点97个。

2.3 构建胆黄润肠丸“药物-活性成分-靶点”网络利用Cytoscape 3.7.1构建胆黄润肠丸的“药物-活性成分-靶点”网络，如图1所示，该网络共包含123个节点（2个药物节点、24个活性成分节点和97个靶点节点）和634 条边。其中，正方形为药物图标，圆形为活性成分图标，菱形为靶点图标。节点度值（degree）越大，图标越大，颜色越深，度值前五的靶点分别为CA2（degree=22）、PIM1（degree=18）、STS（degree=18）、TTR（degree=18）、PPIA（degree=17）。

图1 胆黄润肠丸“药物-化合物-靶点”网络图

2.4 慢传输型便秘关联靶点与“药物-疾病”交集靶点筛选结果用关键词“slow transit constipation”检索OMIM和Genecards数据库，去重后得到STC相关靶点1005个。借助在线平台Venny 2.1绘制胆黄润肠丸与STC 交集靶点韦恩图，共得到“药物-疾病”交集靶点38个，详见图2。与交集靶点密切相关的药物活性成分主要为原花青素B-5,3'-O-没食子酸酯、番泻甙D、大黄素甲醚双葡萄糖甙和猪胆酸等。

图2 胆黄润肠丸-慢传输型便秘交集靶点图

2.5 构建“药物-疾病”交集靶点蛋白互作网络（PPI）应用STRING 数据库构建“药物-疾病”交集靶点互作网络，可知该网络由38 个节点、211 条边组成，平均节点度值为11.1。借助Cytoscape 3.7.1 重新布局交集靶点互作网络，如图3所示，度值（degree）越大则节点图标越大，相互作用越强则节点连线越粗。由图可见，该互作网络中的核心靶点分别为：ALB（degree=32）、EGFR（degree=26）、CASP3（degree=25）、ESR1（degree=23）、HSP90AA1（degree=20）。

图3 胆黄润肠丸-慢传输型便秘交集靶点互作网络图

2.6 “药物-疾病”交集靶点GO 和KEGG 通路富集分析结果应用Metascape 数据库进行胆黄润肠丸与慢传输型便秘38 个交集靶点的GO 和KEGG 富集分析，并通过微生信可视化平台在线作图。由GO 富集分析图（图4）可见，生物过程（Biological process，BP）包括类固醇激素的反应、对无机物的反应、对营养水平的反应等；细胞组分（Cellular component，CC）包括囊泡腔、膜筏、轴突等；分子功能（Molecular function，MF）包括蛋白激酶结合、蛋白域特异性结合、核受体活性等。由KEGG 气泡图（图5）可见，胆黄润肠丸治疗STC主要涉及癌症通路、IL-17信号通路、雌激素信号通路等。

图4 胆黄润肠丸-慢传输型便秘交集靶点GO富集分析图

图5 胆黄润肠丸-慢传输型便秘交集靶点KEGG气泡图

3 讨论

大黄始载于《神农本草经》，历来为通下要药，因其药性“劲利”“骏快”，被陶弘景誉为“将军”[21]。现代研究发现，大黄致泻成分主要为蒽醌类和蒽酮类。未被小肠吸收的结合型蒽醌被大肠内细菌酶水解为蒽酮或蒽酚，一方面通过刺激大肠黏膜和肠壁肌层内神经丛，促进肠道平滑肌收缩而导泻；另一方面通过抑制肠细胞膜上Na+-K+-ATP酶，使肠内渗透压升高，而引起容积性泻下。同时，部分蒽苷由小肠吸收后转化为苷元，再经大肠或胆囊分泌入肠腔而致泻[22-24]。另外，扶垭东等[25]研究发现，生大黄的结合型蒽醌及缩合鞣质均可引起泻下作用。猪胆粉为猪胆汁的干燥品，性微寒，能清热润燥而通热秘。猪胆汁入药首见于《伤寒论》，仲景有云：“和少许法醋，以灌谷道内，如一食顷，当大便出宿食恶物甚效。”[26]现代研究证实，猪胆汁能作用于M胆碱与α肾上腺素受体，促进肠纵肌收缩，加强肠蠕动。胆盐类成分能抑制结肠吸收盐分和水分，刺激副交感神经，增加结肠积液。胆汁酸类成分口服能刺激胆汁分泌，促进脂类吸收和胆固醇代谢，并产生轻泻作用[27-29]。以上诸多研究进一步验证了笔者的网络药理分析结果，即胆黄润肠丸治疗STC的主要活性成分为原花青素B-5,3'-O-没食子酸酯、番泻甙D、大黄素甲醚双葡萄糖甙和猪胆酸。

笔者构建“药物-疾病”交集靶点PPI 时发现，ALB、EGFR、CASP3、ESR1、HSP90AA1 等为PPI 核心靶点。ALB 是血清白蛋白，有研究发现，便秘症状缓解患者的ALB水平显著提高，与患者营养状况改善有关[30]。EGFR 是表皮生长因子受体，有研究[31]证实，缺乏EGFR 信号传导标志物的小鼠有排泄增加的现象，并有机构由此研发治疗便秘的药物。CASP3 是参与细胞凋亡的半胱天冬酶，临床研究[32]表明，与慢传输便秘等消化道疾病有关的“rhEGC 表型”会导致CASP3 的信使RNA 转录发生一定程度上调，提示CASP3 可能通过影响肠神经胶质细胞（EGC）来调节胃肠动力。ESR1是雌激素受体α（ERα）基因，定位于肠神经节和平滑肌细胞，是介导肠道运动的成分，动物实验[33]发现，肠道发育过程中ERα 表达增加。HSP90AA1是热休克蛋白，Li Pengpeng等[34]发现，表达HSP90AA1 的大肠杆菌细胞表现出更好的膜完整性，推测该蛋白对维护肠道菌群平衡和肠道正常功能起到一定辅助作用。GO富集结果涉及类固醇激素的反应、对营养水平的反应、囊泡腔、膜筏、蛋白激酶结合、蛋白域特异性结合等，与PPI核心靶点作用基本一致。

由KEGG 富集结果可见，胆黄润肠丸治疗STC 主要涉及癌症、IL-17、雌激素等信号通路。Cajal间质细胞（ICC）是胃肠道慢波起搏细胞，平滑肌张力感受器，可传导肠神经与平滑肌间的神经信号。郑宏群等[35]发现，腹腔注射TNF-α（肿瘤坏死因子α）的鼠小肠ICC 及细胞网络均有不同程度损伤，推测TNF-α 与ICC 线粒体损伤存在一定关联性，也是导致消化道动力障碍的诱因。IL-17 由T 辅助细胞Th17 产生，可直接或间接诱导多种细胞因子、趋化因子、炎症因子和抗微生物蛋白。曹蕾等[36]研究证实，IL-17A mRNA和蛋白在功能性便秘患者的结肠黏膜中具有高表达，说明IL-17A参与了功能性便秘的发病或病理过程。李敏等[37]发现，术后肠梗阻的小鼠出现菌群失调、炎症反应、胃肠动力障碍一系列症状，血清IL-17等炎症细胞因子水平显著升高，推测小鼠因肠道5-HT 和HIS释放异常，5-HT无法与受体结合，从而导致胃肠道平滑肌张力减弱。一方面，雌激素可使NO 合成酶（NOS）的mRNA 高表达，通过合成NO、升高cGMP 来抑制结肠运动。另一方面，肠内雌激素受体ERβ阻断后c-kit mRNA 表达降低，影响ICC 的正常生理功能，也会造成胃肠道动力不足[38]。此外，雌激素可阻滞H+-K+-ATP 酶，作用于神经内分泌细胞，抑制胃酸分泌，导致功能性消化不良。同时，雌激素阻止胰腺腺泡蛋白酶和淀粉酶的分泌，在胃排空延迟、缺少足够食物、胃酸刺激的情况下，胆囊收缩素释放减少，胰酶和胆汁的分泌减少均会对胃肠道运化功能造成一定影响[39]。

综上，笔者运用网络药理学初步探究了胆黄润肠丸治疗STC 的主要活性成分、核心靶点以及作用机制，为今后开展相关临床研究提供参考。该研究还比较局限，如：胆黄润肠丸由大黄和猪胆粉经混合粉碎泛制而成，而饮片粉碎和喷洒黏合剂（水或乙醇）的过程中可能会产生一些新的化合物，这些化合物的生物活性和作用机理还是个未知数，有待进一步研究和探讨。