葛根提取物薄层鉴别与含量测定

陈炎欢，冯华业，黄照荣，江志鹏，黄绮敏

（无限极（中国）有限公司，广东江门 529100）

葛根提取物是由豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根提取制得，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络及解酒毒等作用，是药食两用的天然植物资源。葛根提取物作为市场畅销的中药提取物之一，制定其质量标准对其在中药产业的发展有非常重要的意义[1-5]。本文主要对葛根提取物中的葛根素进行薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）和高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）鉴别和含量测定，为制定葛根提取物的质量标准提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

葛根提取物，由无限极（中国）有限公司提供；葛根素对照品，批号：201816，购自中国食品药品检定研究院；高效硅胶G薄层板，分别购自德国Merck和青岛海洋化工有限公司；甲醇、三氯甲烷，分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.2 仪器

ThermoFisher UltiMate 3000高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器（Diode Array Detector，DAD）；瑞士Mettler XPR2型百万分之一电子天平；Fisherbrand FB11209型超声波清洗仪。

1.3 试验方法

1.3.1 薄层色谱鉴别

（1）对照品溶液配制。取葛根对照药材0.8 g，置于锥形瓶中，加入甲醇6 mL，超声（250 W，40 Hz）处理30 min，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。

（2）供试品溶液配制。取本品粉末约0.1 g，置于锥形瓶中，加入甲醇10 mL，超声（250 W，40 Hz）处理30 min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取葛根素对照品适量，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为供试品溶液。

（3）薄层色谱测定。按照薄层色谱法（中国药典2020年版通则0502）试验，吸取上述3种溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7.00∶2.50∶0.25）为展开剂，取出晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

1.3.2 含量测定

（1）色谱条件。色谱柱：C18色谱柱（150 mm或250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（25∶75，体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；波长：250 nm；进样量：10 μL；理论塔板数按葛根素计不低于4000。葛根素与其他组分能得到很好的分离，且出峰时间适宜，峰形良好。

（2）对照品溶液制备。精密称取葛根素对照品12.5 mg于100 mL容量瓶，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到125 μg/mL葛根素对照品储备液。

（3）供试品溶液制备。精确称取粉碎均匀的葛根提取物样品约0.1 g，置100 mL容量瓶中，加入30%乙醇约80 mL，超声（250 W，40 Hz）处理30 min，取出，冷却后定容至刻度，摇匀。取上清液1 mL至5 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，即为稀释5倍的测试液。取适量样液过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液后供液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱鉴别

取葛根对照药材、葛根素、葛根提取物进行测试。由图1可知，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，Rf值在0.3～0.7，符合薄层鉴别要求。

图1 对照品及葛根提取物薄层图

2.2 线性关系考察

精密称取葛根素对照品13.10 mg于100 mL容量瓶，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到124.97 μg/mL葛根素对照品储备液。精密吸取葛根素对照品储备液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、 4.0 mL及5.0 mL分别置10 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，在规定色谱条件下进行色谱分析，测定峰面积。以葛根素对照品浓度（µg/mL）为横坐标，平均峰面积为纵坐标，制作标准曲线（图2），求出线性回归程为Y=0.7675X+0.0498，R2=0.9996。结果表明葛根素在6.25～62.49 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

图2 葛根素标准曲线

2.3 精密度试验

精密吸取葛根素对照品溶液（浓度37.49 μg/mL）10 μL进样，重复进样6次，分别计算峰面积及保留时间的RSD值，保留时间和峰面积的RSD值分别为0.57%和0.28%。理论塔板数以葛根素计约6000，表明仪器精密度良好，结果见表1。

表1 精密度试验结果（n=6）

2.4 稳定性试验

取葛根提取物按上述色谱条件分别于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h及24 h测定，结果见表2，供试品中葛根素峰面积的RSD为0.22%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

表2 稳定性试验结果（n=6）

2.5 重复性试验

取葛根提取物同一天内按上述色谱条件测定，结果见表3。葛根素平均含量为15.67%，RSD为0.56%，分离度大于1.5。表明该方法重复性良好。

表3 重复性试验结果

2.6 回收率试验

取葛根提取物（葛根素含量为15.67%）精密称定约0.05 g于9个100 mL小烧杯中。另取葛根素对照 品（纯 度95.4%）165.493 mg置100 mL容 量 瓶中，加30%乙醇溶解并定容（此对照品溶液含葛根素 1.5788 g/mL），分别吸取该对照品溶液2.5 mL（以葛根素计3.9470 mg）、5.0 mL（以葛根素计7.8940 mg）、 7.5 mL（以葛根素计11.8410 mg），分3组加入含样品的9个100 mL容量瓶中，按色谱条件测定，计算葛根素的回收率，回收率数据分别为99.39%、103.90%、101.79%、102.56%、103.99%、103.83%、102.12%、104.63%及102.84%，平 均 回 收 率 为102.78%（95%～105%），RSD值为1.55%，表明该方法准确度良好。

2.7 样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶各10 μL，注入液相色谱仪，测定。根据所得对照品溶液和供试品溶液色谱图中葛根素峰面积计算供试品中待测组分葛根素含量，结果见表4。

表4 样品的含量测定结果（n=3）

3 结论与讨论

葛根提取物经过提取后，与葛根药材在基质上存在差别，本研究中的鉴别方法，与中国药典中葛根药材的供试品溶液制备方法略有不同，试验结果表明，本研究方法满足薄层鉴别的要求，可用于葛根提取物的鉴别。本研究方法稳定性、精密度、重复性以及准确度均符合方法学的要求，可用于葛根提取物葛根素含量的检测