茯神质量标准提升研究

文鑫鑫，万力华，龙 滢

(黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556000)

茯神(Poria cum Radix Pini)为贵州省的民族用药，药用部位为茯苓干燥菌核中间抱有松枝或松根的白色部分[1]。国内对茯神化学成分的研究历史已有二十多年，目前从茯神中分离鉴定出的特征化合物有几十种，主要成分是多糖及三萜类化合物，多糖成分主要是茯苓多糖，三萜类成分主要有茯苓酸等[1]。《贵州省中药材质量标准》收载该品种，标准建立时间较早，方法简单，仅有性状检查，横截面及粉末的显微鉴别及理化反应。本次试验根据药典方法检查显微、水分等常规项目，重点尝试建立含量测定的方法，因国内尚无茯神中三萜类成分茯苓酸的法定标准品，本次试验新增以多糖为检测指标的含量测定方法。

1 仪器和材料

1.1 仪器

莱卡DM2500显微镜和LAS V3.8显像系统，Shimadzu UV-2600、UVProbe2.52工作站，Shimadzu UV-2700、UVprobe2.43工作站，数显式电热恒温六孔水浴锅，XPE205电子天平，数控超声机器[7]。

1.2 试剂试药

D-无水葡萄糖(中检院 110833-201707 含量99.9%)、硫酸(重庆川东化工(集团)有限公司20160401)、蒽酮(天津市科密欧化学试剂开发中心 20061021)均为分析纯；氯仿、环己烷、乙醚等均为国药集团采购，为分析纯；硅胶G板采购于青岛海洋、胜海；滤纸为定性滤纸。本次所有实验样品均通过贵州中医大(原贵阳中医学院)孙庆文教授准确鉴定为茯神，凭证标本存贵州省食品药品检验所。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

松枝横切面：松枝外侧带有灰白色菌丝。晚材由3～5列管胞或纤维管胞组成，类长方形或长椭圆形，切向延长，长25～60 μm，宽约35 μm，壁厚10～15 μm，木化。早材管胞呈多边形或类圆形，直径50～90 μm，壁厚8～12 μm，木化。射线宽1～2列细胞，树脂道类圆形，直径150～400 μm，上皮细胞已脱落(图1)。

图1 松枝横切面显微鉴别Fig.1 Microscopic identification of pine branch cross section

粉末显微特征：粉末灰黄白色。管胞众多，直径50～90 μm，厚8～15 μm，具缘纹孔呈两行相对排列或一行单列，纹孔直径20～30 μm。纤维管胞直径35～60 μm，具单斜纹孔，孔径15～30 μm。射线薄壁细胞长条形。菌丝分有节菌丝和无节菌丝，极少有棕色菌丝。色素块黄棕色或红棕色(图2)。

图2 粉末显微鉴别Fig.2 Microscopic identification of powder

2.2 薄层色谱

称取茯神粉末约1 g，加入乙醚50 mL，超声处理约10 min，滤过，滤液在水浴上蒸干，残渣用甲醇1 mL使溶解，即得供试品[8]。照药典薄层色谱法[5]试验，取一张活化好的硅胶G板，点样量4 μL，展开剂为：三氯甲烷-环己烷-醋酸乙酯-甲酸，展开剂比例为(V∶V)(7∶2∶2∶0.2)，显色剂为含1%香草醛的硫酸溶液，喷洒均匀，105 ℃加热至斑点清晰。供试品在与对照药材相同的位置显相同颜色的斑点，结果见图3。

图3 不同批样品薄层色谱图Fig.3 TLC of different samples

2.3 水分、灰分和浸出物

2.3.1 水分

依据药典[5]水分测定法的第二法，分别对不同产地的三批次茯神药材样品测定水分。其值为12.5%～13.1%，均值为12.7%(结果见表1)。茯神不含挥发性物质，所以本次试验水分的测定方法选用了烘干法。

2.3.2 总灰分

依据药典[5]四部通则，分别对不同产地三批次茯神药材样品测定总灰分。其值为0.25%～0.55%，均值为0.366%(结果见表1)。

2.3.3 浸出物

依据药典[5]四部通则，以其中一批茯神(FS001)为样品，分别用不同含量乙醇作为溶剂，对冷浸、热浸法进行比较，根据测定结果，选稀乙醇作溶剂。测定了3批样品，以干燥品计算浸出物的含量，其值为5.4%～5.6%，均值为5.5%(结果见表1)。

表1 不同批号的茯神水分、总灰分、浸出物Tab.1 The moisture，total ash，and extracts of different samples

2.4 含量测定

2.4.1 标准溶液制备

精密称取对照品(D-无水葡萄糖)适量，加水溶解并稀释成每1 mL中含无水葡萄糖约0.1 mg[7]。

2.4.2 样品溶液的制备

样品打粉过2号筛，精密称取约0.9 g，置具塞锥形瓶中，以80%的乙醇溶液为溶剂，加入50 mL溶剂后，于水浴中回流2 h，用滤纸趁热过滤，残渣用热的溶剂洗涤3次，每次20 mL，将残渣及滤纸放入具塞锥形瓶中，加入50 mL的水，水浴中回流2 h，趁热过滤至250 mL的容量瓶中，用热水洗涤残渣和锥形瓶3次，每次20 mL，洗液并入容量瓶中，待溶液冷却至室温，用水稀释至刻度，即得。同法制备空白溶液。

测定法：取干燥的具塞试管，精密量取样品溶液1 mL加入试管中，加水至2.0 mL，摇匀，精密量取6 mL含0.15%蒽酮的硫酸溶液，快速加入，摇匀，在80 ℃水浴中保温15 min后，再放置于0 ℃水浴中10 min，取出即得[7]。检测波长为624 nm，从线性方程上得出葡萄糖的含量[7]。

2.4.3 线性考察

取具塞试管6支，分别精密加入2.4.1项下溶液0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.0 mL、1.2 mL，照2.4.2项下的方法，自“加水至2.0 mL”起，标准曲线用Origin 2018数据软件绘得，横坐标为对照品葡萄糖的浓度(mg/L)，纵坐标为吸光度A，回归方程为A=0.0131x+0.03333(R2=0.999)，结果表明：该实验条件下葡萄糖在10.86～65.15 mg/L的范围线性关系好[7]。

2.4.4 重复性

分别精密称取6份供试品(编号FS003)约0.9 g，按2.4.2项下操作。经计算得多糖含量分别为：3.15%、3.15%、3.15%、3.20%、3.20%、3.20%，平均值为3.17%，RSD为0.81%。

图4 葡萄糖标准曲线图Fig.4 Glucose standard curve

2.4.5 稳定性

取2.4.4项下溶液，同法检测，每隔1 h读数3次，取平均值，实验表明，显色后供试品的溶液6 h内吸光度差异不大，RSD为1.21%。

2.4.6 回收率

精密称取本品(编号FS003)约0.44 g，各6份，各精密加入确定浓度的对照品溶液，按2.4.2项下操作，结果见表2，均值为101.4%，RSD为1.69%[7]。

表2 加样回收率结果Tab.2 Results of spiked recovery tests

2.5 样品测定

分别称取3批次茯神样品约0.88 g各2份，按照2.4.2项下制备供试品溶液，由2.4.3标准曲线方程计算葡萄糖含量，结果见表3。

表3 不同批号样品含量测定Tab.3 Content determination results of different samples

3 讨论

1)薄层鉴别参考了茯苓药材的药典方法，本方法选用极性低的有机溶剂乙醚提取茯神三萜类成分中极性较低的成分，避免了提取出的成分过多过杂。原方法的展开剂中含有甲苯，因为甲苯的毒性，希望选择毒性较低的有机溶剂替代，通过对茯神的展开剂进行了比较和研究，选择用三氯甲烷和环己烷的组合替代甲苯，该组合的斑点分离度好，显色清晰，最终选用了三氯甲烷-环己烷-乙酸乙酯-甲酸(v∶v，7∶2∶2∶0.2)作为茯神薄层定性鉴别的展开剂。本试验同时考察了不同品牌厂家(青岛胜海，青岛海洋化工)、不同环境温度(5 ℃，20 ℃，35 ℃)、不同环境湿度(28%，52%，88%)等对茯神薄层鉴别分离效果的影响，结果表明这些因素对分离效果影响不大，该方法分离度好、简单、耐用性好。

2)本文关于茯神多糖含量测定对多糖常用的检测方法蒽酮比色法和苯酚比色法进行比较研究，蒽酮比色法的线性、精密度等方面很理想，能很好地满足茯神含量测定的要求。本实验同时考察了提取溶剂、提取方法、提取时间等，以及蒽酮硫酸的浓度、显色时间、温度，最终确定最优含量测定方法。不同产地的茯神含量相对稳定，差异不大。

3)本文对3批次的茯神质量进行了显微鉴别、薄层色谱鉴别、多糖含量测定、水分等项目的考察，结果显示方法可行，可用作茯神的地方质量标准控制。