大鼠肠系膜淋巴液持续引流新方法的初步建立

张笑瑞, 曹 静, 吴倩倩, 康 康, 陈国元, 吴宝金

(1. 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心动物实验技术平台,上海 200031; 2. 上海中医药大学科技实验中心实验动物中心,上海 200031)

肠淋巴系统参与机体免疫细胞运输［1］、体液平衡［2］、内环境稳态［3］、肠道饱腹感信号的传递［4］和膳食脂质的运输［5］。在病理状态下，淋巴液中会出现肿瘤细胞和病毒等特异性生物标志物［6-7］，其含量显著高于外周血［8-9］，通过分析淋巴液有助于了解病理机制并进行早期诊断。自1948年Bollman等［10］首次建立了大鼠肠系膜淋巴液引流技术以来，越来越多的研究者利用该技术开展各种研究。但在引流肠系膜淋巴液时，动物长时间处于麻醉或被限制的状态［11-13］，导致动物肠系膜淋巴液流速和淋巴转运能力下降［14］，部分实验中动物还需接受胃或十二指肠插管手术以补充营养物质，对动物产生额外的损伤，这些因素均会影响肠系膜淋巴系统的研究和该方法的应用。

近年来，有研究者采用一种大鼠胆汁辅助回流装置，实现了胆汁的实时连续收集，被广泛应用于消化系统疾病方面的研究［15］。本文采用这种胆汁辅助回流装置，建立大鼠肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流技术，以实现大鼠在清醒自由状态下实时、长期收集淋巴液，且能避免手术应激、全身麻醉或动物受限对肠系膜淋巴液形成和组成的影响，从而为肠系膜淋巴系统功能的深入研究提供一种创新的肠系膜淋巴液采集的技术手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠16 只，8 周龄，体质量（250±9）g，购自上海杰思捷实验动物有限公司［SCXK（沪）2018-0004、SCXK（沪）2019-0001］，质量合格证号为20180004058749、20211221Aazz061900169。所有大鼠均饲养于中国科学院分子细胞科学卓越创新中心实验动物屏障设施［SYXK（沪）2018-0007］，自由饮食，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，噪声≤60 dB，生活照明20 lx（12/12 h明暗循环）；全部大鼠每笼不超过3只，适应性饲养7 d后开始实验。本研究中所有实验程序经中国科学院分子细胞科学卓越创新中心实验动物使用与管理委员会审查批准（IACUC No.SIBCB-S118340-2112-045），手术操作均按照《实验动物护理和使用指南》在超净工作台中完成。

1.2 仪器与试剂

体视显微镜（SZX16）为日本Olympus 公司产品；微量注射泵（XFP01-BD）为苏州讯飞科学仪器有限公司产品；全自动血液分析仪XN-1000 为日本SYSMEX（希森美康） 公司产品；大鼠2 通道VAB 系绳（VABR2T/25）、大鼠2 通道血管通路按钮（VABR2B/25R22）、大鼠2 通道VAB 回路连接器（VABR2L）、PinPort 进样器（PNP3M）、2 通道转子（375/D/25LT）、多轴平衡臂（MCLA/MED）、 大鼠采样笼器具（MTANK/WF） 和 聚 氨 酯（polyurethane，PU） 导 管（BTPU-027、BTPU-040）均购自美国Instech公司，硅胶导管（3 Fr、5 Fr） 购自美国SAI 公司。舒泰50（Zoletil 50） 购自法国Virbac 公司；医用组织胶水（1469SB）购自美国3M 公司；全血稀释液CELLPACK DCL，溶血剂Lysercell WNR和LysercellTM WDF，血细胞分析用染色液Fluorocell WNR、Fluorocell WDF 和Fluorocell PLT，清洗液和校准品（XN CAL/XN CAL PF）均购自日本SYSMEX（希森美康）公司；体外诊断试剂干片购自美国Ortho公司。

1.3 实验分组与模型制备

将16 只雄性SD 大鼠随机分为2 组（8 只/组）：实验组和对照组。麻醉状态下，实验组行肠淋巴管及颈静脉双插管手术，建立大鼠肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流技术模型；对照组行肠系膜淋巴管及十二指肠双插管手术，建立传统引流模型。图1 示大鼠肠系膜淋巴液收集装置，图2示大鼠肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流模型建立过程图。

1.3.1 术前准备

（1）动物术前准备：大鼠术前0.5 h口服灌胃玉米油（5 mL/kg），随着小肠脂质的吸收产生乳白色的乳糜微粒，定位肠系膜淋巴管［16］。

（2）制备大鼠颈静脉套管：将5 Fr硅胶管套至PU管（BTPU-027）形成固定扣。制备大鼠肠系膜淋巴管套管：将3 Fr硅胶导管套至PU管（BTPU-040）。用酒精灯加热PU管尖端，使其成圆弧状（图1A）。

图1 大鼠肠系膜淋巴液收集Figure 1 Collection of rat intestinal lymphatic fluid

1.3.2 实验组模型制备

（1）肠系膜淋巴管插管：在腹中线上腹部2/3处做3～4 cm的正中切口，打开腹膜腔。用无菌纱布将胃肠脏器推至左腹侧腹膜下固定，暴露出左肾静脉和下腔静脉区域，此时可观察到与肠系膜动脉（鲜红色、有波动感）并行的乳白色肠系膜淋巴管（图2A）。在体视显微镜下分离肠系膜淋巴管（直径0.5～1 cm），并用动脉夹和结扎线临时阻断通路。在淋巴管上方45°角做切口，插入淋巴导管并下行1 cm，此时可见导管中的淋巴液流动，分别固定1 cm 固定扣和淋巴管肠端。取出纱布，将导管呈C 型紧贴于腹壁内侧，并将导管4 cm、5.5 cm 和7 cm 处的固定扣固定于腹壁内肌肉（图2B），脏器位置还原至原始状态。将导管另一端引导并接入颈部VAB的淋巴管端口。

（2）颈静脉插管：在颈腹部左侧锁骨区域的皮肤上做0.5 cm 的切口，暴露颈外静脉，并用动脉夹和结扎线临时阻断通路（图2C）。在血管上方45°角做切口，根据大鼠颈部血管走势，插入静脉导管并下行3.5 cm 到达左锁骨下静脉处，分别固定导管3.5 cm 处固定扣和颈浅静脉近心端（图2D）。将导管另一端引导并接入VAB的颈静脉端口。完成插管后，将VAB和VAB回路连接器相连（图2E，图2F），缝合创口。

图2 大鼠肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流模型建立过程图Figure 2 Establishment of auxiliary reflux model of mesenteric lymph

（3）清醒活动装置连接：将VAB、2 通道VAB 系绳、转子、多轴平衡臂、采样笼盒连接，将收集导管放置在淋巴插管的高度（图1B，图1C）。

1.3.3 对照组模型制备

（1）肠系膜淋巴管插管：手术位置同实验组，在肠系膜淋巴管上穿刺并插入导管，组织胶水固定。插管成功后将导管的另一端穿出体外，以收集淋巴液。

（2）十二指肠插管：在幽门下方约2 cm 的十二指肠上穿刺并插入导管，组织胶水固定后，将导管另一端传出体外连接至微量注射泵，将大鼠放置固定器内（图1E）。

1.4 淋巴液流量测定

对照组大鼠在术后连续1 h收集肠系膜淋巴液，实验组大鼠术后恢复7 d 后连续1 h 收集肠系膜淋巴液。收集过程中以3 mL/h 的速度将林格液分别注入十二指肠和颈静脉管中，对大鼠进行补液［17］。测量单位小时内收集的淋巴液体积，计算肠系膜淋巴液流量。

1.5 淋巴液细胞成分测定

定量提取20 μL 淋巴液与120 μL CELLPACK DCL稀释液，混匀。使用全自动血液分析仪XN-1000 检测白细胞总数（total number of white blood cells，WBC）、中性粒细胞数（number of neutrophil，NEUT#）、淋巴细胞数（number of lymphocyte，LYM#）、单核细胞数（number of monocyte，MONO#）、嗜酸性粒细胞数（number of eosinophilia，EOS#）、嗜碱性粒细胞数（number of basophil，BASO#）、中性粒细胞比例（percentage of neutrophil，NEUT/%）、淋巴细胞百分率（percentage of lymphocyte，LYM/%）、单核细胞比例（percentage of monocyte，MONO/%）、嗜酸性粒细胞百分比（percentage of eosinophilia，EOS/%）和嗜碱性粒细胞百分比（percentage of basophil，BASO/%）。

1.6 淋巴液生化成分测定

收集的淋巴液静置30 min后离心（5 min，3 000 r/min），取得上清液，检测电解质指标K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+和P3+，物质代谢指标尿素（urea，UREA）、肌酐（creatinine，CRE）、尿酸（uric acid，URIC）、葡萄糖（glucose，GLU）、三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，CHO）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL），蛋白水平指标总蛋白（total protein，TP）和白蛋白（albumin，Alb），以及酸碱指标二氧化碳（CO2）。

1.7 麻醉方法

使用舒泰50 以50 mg/kg 的剂量肌内注射给SD 大鼠，观察大鼠呼吸频率降低、肌肉舒张和无疼痛反射后，将其仰卧位置于手术台上，四肢用胶带固定。

1.8 数据统计方法

数据分析和绘图使用GraphPad Prism 8.0 软件，计量数据以±s表示。淋巴液流量测定数据比较采用配对t检验，其余数据比较采用多个样本t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流技术模型的效果

行肠淋巴管及颈静脉双插管手术建立的大鼠肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流模型与清醒活动装置组成了一个大鼠肠系膜淋巴液引流系统，该系统在术后第7天仍可以实时收集肠系膜淋巴液。并且，在此期间动物无异常。

2.2 淋巴液流速测定

经测定，实验组动物肠系膜淋巴液流量为（2.01±0.12）mL/h，对照组流量为（0.92±0.09）mL/h。与对照组相比，实验组动物肠系膜淋巴液流量显著升高（P＜0.01）。

2.3 淋巴液细胞成分

与对照组相比，实验组大鼠淋巴液中LYM#和LYM/%显著升高（P＜0.01，P＜0.05），NEUT/%和MONO/%显著降低（均P＜0.01），其他指标差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 对照组与实验组大鼠淋巴液细胞成分Table 1 Lymphocyte composition of rats in the control and experimental group（ ±s）

表1 对照组与实验组大鼠淋巴液细胞成分Table 1 Lymphocyte composition of rats in the control and experimental group（ ±s）

注：WBC 为白细胞总数，NEUT#为中性粒细胞数，LYM#为淋巴细胞数，MONO#为单核细胞数，EOS#为嗜酸性粒细胞，BASO#为嗜碱性粒细胞，NEUT/%为中性粒细胞比例，LYM/%为淋巴细胞百分率，MONO/%为单核细胞比例，EOS/%为嗜酸性粒细胞百分比，BASO/%为嗜碱性粒细胞百分比。与对照组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note: WBC, total number of white blood cells; NEUT#, number of neutrophils; LYM#, number of lymphocytes; MONO#, number of monocytes; EOS#, number of eosinophilia; BASO#, number of baso-phils; NEUT/%, percentage of neutrophils; LYM/%, percentage of lymphocytes; MONO/%, percentage of monocytes; EOS/%,percentage of eosinophilia;BASO/%,percentage ofbasophils.Compared to the control group, ★P＜0.05, ★★P＜0.01.

血细胞分类Blood cell classification WBC/(109·L-1)NEUT#/(109·L-1)LYM#/(109·L-1)MONO#/(109·L-1)EOS#/(109·L-1)BASO#/(109·L-1)NEUT/%LYM/%MONO/%EOS/%BASO/%对照组Control group(n=8)7.48±3.45 0.79±0.42 2.14±1.03 4.54±2.36 0.01±0.01 0.01±0.01 11.20±4.51 28.23±6.78 60.36±9.81 0.15±0.12 0.06±0.07实验组Experimental group(n=8)14.01±9.93 0.45±0.20 7.34±4.89★6.21±5.09 0.01±0.01 0.01±0.00 4.35±2.16★★51.99±7.40★★43.44±6.61★★0.14±0.15 0.09±0.14

2.4 淋巴上清液生化指标

与对照组相比，实验组大鼠淋巴液中K+、Na+、CO2、UREA显著升高（P＜0.05或P＜0.01），TG和P3+显著降低（均P＜0.01），其他指标差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 对照组与实验组大鼠淋巴液生化指标Table 2 Comparison of biochemistry indexes of rats in the control and experimental group（ ±s）

表2 对照组与实验组大鼠淋巴液生化指标Table 2 Comparison of biochemistry indexes of rats in the control and experimental group（ ±s）

注：UREA为尿素，CRE为肌酐，URIC为尿酸，GLU为葡萄糖，TG为三酰甘油，CHO 为总胆固醇，HDL 为高密度脂蛋白，TP 为总蛋白，ALB为白蛋白。与对照组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note：UREA，urea；CRE，creatinine；URIC，uric acid；GLU，glucose；TG，triglyceride；CHO，total cholesterol；HDL，highdensity lipoprotein；TP，total protein；ALB，albumin. Compared to the control group，★P＜0.05，★★P＜0.01.

生化指标Biochemical indicators Cl-c/(mmol·L-1)K+c/(mmol·L-1)Na+c/(mmol·L-1)P3+c/(mmol·L-1)Ca2+c/(mmol·L-1)Mg2+c/(mmol·L-1)UREA c/(mmol·L-1)CRE c/(µmol·L-1)URIC c/(mmol·L-1)GLU c/(mmol·L-1)TG c/(mmol·L-1)CHO c/(mmol·L-1)HDL c/(mmol·L-1)TP ρ/(g·L-1)ALB ρ/(g·L-1)CO2 c/(mmol·L-1)对照组Control group(n=8)99.75±1.85 4.75±0.74 136.75±1.48 3.79±0.18 2.65±0.11 0.90±0.13 5.13±0.33 23.56±8.91 37.81±21.46 12.83±3.01 3.63±1.02 1.69±0.16 1.16±0.13 47.05±2.35 24.81±1.91 22.50±2.45实验组Experimental group(n=8)100.75±1.71 5.74±0.21★★139.63±1.58★★3.49±0.11★★2.66±0.05 0.93±0.07 5.75±0.66★24.61±3.50 51.19±8.85 14.66±1.55 1.57±0.47★★1.62±0.20 1.15±0.15 45.31±1.19 23.51±0.66 27.25±1.09★★

3 讨论

3.1 新方法的优势

文献［14］报告，国内外学者多选择在动物术后并处于麻醉或束缚的状态下收集淋巴液，这虽然缩短了实验时间，且保证了样本收集的成功率，但会带来一些问题：（1）动物在麻醉状态下会出现胃排空减少、小肠毛细血管通透性改变、淋巴转运能力下降，本研究中对照组和实验组的淋巴液流速也证实了这一点；（2）只能间断地收集淋巴液，不能准确计算出经淋巴转运药物的总量，使模型应用受到了限制；（3）为了方便给药，有学者还要对大鼠进行十二指肠插管，通过导管持续输注脂质与药物来评价其经淋巴转移的能力，然而胃内分泌物以及神经传导在整个消化过程中发挥关键作用，因此在这种病理生理状态下获取的数据可能存在偏差；（4）动物饮食受到限制，需要通过皮下注射或胃肠插管输注营养液来维持动物体液平衡和体能。

本研究中使用的淋巴液收集系统能够实现大鼠在完全清醒、自由活动、不限制饮食的状态下，实时并长期收集淋巴液、血液或给药，避免了手术应激、全身麻醉或动物受限对肠系膜淋巴液形成和组成的影响。该模型具有十分显著的优势（表3）：（1）在插管完成后，利用VAB 回路连接器建立一条新的淋巴循环通路，动物可以在愈后健康状态下开展实验，避免麻醉、创伤、感染等因素对实验造成干扰，实现对药物经淋巴转运更精确和长期的测量；（2）通过建立淋巴液-血液循环通路，可以根据实验需求随时阻断肠系膜淋巴液，同时结合全自动采血给药仪，还可以实现完全自动化的淋巴液和血液采集或静脉给药；（3）由于淋巴引流的管路呈U 型结构且两端口的液面一致，根据等高液面压强相等的原理，此时导管内淋巴液流量等同于肠系膜淋巴管内实际流量，并且在淋巴引流过程中，可以根据淋巴液流速和血液损耗量精准补充等渗离子溶液，维持机体体液平衡和内环境稳态。

表3 大鼠肠系膜淋巴液引流新旧技术对比Table 3 Comparison of novel and traditional techniques for intestinal lymphatic drainage in rats

3.2 淋巴液流速及成分的比较分析

与对照组相比，实验组动物淋巴液流速显著升高，这可能与受试动物的体质量、脂质摄入、麻醉或受约束以及感染等生理状况有关［14，18］。在细胞成分检测中，实验组动物的LYMPH#和LYMPH/%显著升高，推测与动物在麻醉状态下，胸腺、脾脏和其他中枢淋巴器官的淋巴细胞转运能力下降有关［14］；并且NEUT/%和MONO/%显著降低，这可能与对照组动物在术后立即提取淋巴液，机体存在疼痛应激及炎性反应有关［19］。在生化成分检测中，实验组动物的电解质指标K+和Na+显著升高，而P3+显著降低，这可能与两组动物对林格液的吸收方式有关；实验组动物的物质代谢指标UREA 显著升高，这主要与对照组动物禁食导致蛋白质摄入不足有关；实验组动物TG显著降低，这是因为对照组动物在术前口服大量玉米油，经消化分解为TG再转运至肠系膜淋巴系统；实验组动物的酸碱指标CO2显著升高，这可能与麻醉状态下组织细胞的代谢有关，另一个侧面也提示淋巴液呈碱性环境，淋巴液的碱性物质可对抗休克所导致的酸中毒，这可能是淋巴液抗休克的作用机制之一［20］。经验证，实验组模型的细胞成分与生化指标均符合大鼠正常生理水平［21］，具有可靠性和可重复性，可以成功取代之前的模型。

3.3 模型制备的注意事项

在肠淋巴插管的位置选择上，国内外学者的描述较为模糊。很多学者选择在右肾动脉并行的淋巴管处插管，但该处是肠系膜淋巴管和辅助淋巴管的汇集处，因此收集的淋巴液无法准确评估脂质类药物经肠道淋巴转运的真实情况。也有学者选择切断这一辅助淋巴管的通路，这增加了手术的难度和风险［17］。本研究中选择与肠系膜动脉并行的淋巴管，手术难度较低且可以精准收集全部肠系膜淋巴液。同时由于淋巴液和淋巴管呈无色透明状，通过在术前让大鼠口服玉米油使其生成乳白色的乳糜微粒［16］，可准确定位肠系膜淋巴管，这主要是因为脂质降解形成的长链脂肪酸（14 C～24 C）可与其他脂类产物生成乳白色牛奶状的乳糜微粒［1，20，22］。对于腹腔内导管的处理方式在不同的研究中也有差异。很多人选择预留部分导管在腹腔内，以防止导管拉扯而脱离淋巴管，但这容易引发肠道蠕动时与导管发生缠绕，导致大鼠死亡。本研究中将导管呈C 型走位贴于腹腔内壁，结果提示这是维持动物高存活率的又一保障。

肠系膜淋巴管壁非常脆弱，且在分离淋巴管时极容易破坏周边淋巴组织，从而导致淋巴液回流到乳糜池受阻。因此，该方法对于术者的显微外科技能要求较高。此外，应选择一套适合的显微手术器械和自制导管。显微器械可精准分离出血管和淋巴管，减少其周围组织受损。有学者将导管的头端斜切形成尖锐的角度，虽便于插管，但极易划伤或刺破管壁，且在抽取体液时，由于导管尖端产生负压，极易贴合血管或淋巴管内壁，导致导管不通［17］。本研究中自制的导管头端圆滑，且材质选用医用级材料，不易出现组织排异。另外在导管固定方面，有学者使用医用胶水固定插入导管［17］，一方面导管牢固度不明，另一方面胶水会破坏周边结缔组织，甚至会影响局部微循环［16］。在进行腹腔手术时，复原腹腔脏器的位置往往容易被忽略，脏器异位可致动物死亡［16］。由于肠系膜淋巴结分布密集，淋巴液内成分在经过这些多级淋巴结后会如何变化，还有待进一步研究。且肠系膜与小肠是一个有机整体，而小肠的不同部位其消化吸收功能有一定差异，因此，针对不同肠段及淋巴结精准提取其淋巴液的技术尚待进一步优化。

综上所述，该技术方法可以在大鼠清醒、正常活动状况下反复、实时收集肠系膜淋巴液，用于脂质、蛋白质、外泌体、电解质及免疫细胞等的定性和定量分析，有助于我们更好地认知肠道毛细淋巴管吸收能力及功能状态。因此，本研究为肠系膜淋巴液的采集提供了新的技术方法，在涉及肠道淋巴的生理功能、脂溶性药物吸收、肠道疾病诊断及其机制研究中有很好的应用价值。

［医学伦理声明Medical Ethics Statement］

本研究涉及的所有动物实验通过中国科学院分子细胞科学卓越创新中心实验动物使用与管理委员会的审核批准（IACUC No.SIBCB-S118340-2112-045）。所有实验操作均遵照中国科学院分子细胞科学卓越创新中心动物实验技术平台发布的《动物实验技术平台标准操作规程》的条例进行。

All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by the Laboratory Animal Use and Management Committee of the Center for Excellence in Molecular Cell Science，Chinese Academy of Sciences（IACUC No. SIBCB-S118340-2112-045）. All experimental procedures were carried out in accordance with the regulations ofStandard Operating Procedures for Animal Experiment Technology Platformsestablished by Animal Core Facility，Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology，Center for Excellence in Molecular Cell Science，Chinese Academy of Sciences.

[作者贡献Author Contribution]

张笑瑞、曹静和吴倩倩负责收集资料、实验设计、实验操作、数据及论文撰写；陈国元和康康负责淋巴液的细胞学及生化指标分析，并参与论文撰写；吴宝金提供研究经费，负责研究方案与论文的审核及修改。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。