γ-分泌酶抑制剂在肺纤维化上皮间质转化中的作用

韩姣，王华兵，徐玲文，董芳

肺纤维化预后极差，严重影响患者的生存质量［1-2］。特发性肺纤维化（IPF）是一种严重的、发展性的、原因不明的纤维间质性肺炎，多数患者预后不良［1］。目前，间质性肺疾病、肺结核、肺癌放疗、肺部寄生虫感染等均可引起肺纤维化的形成，但是肺纤维化发生、发展的具体机制尚不明确。有研究证实，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是引起肺纤维化的重要步骤［3］。Notch信号是一条保守的信号转导途径，在肺组织早期发育过程中，其家族成员对肺上皮细胞的发育［4-5］、生长及凋亡［6-7］起着重要的调控作用。γ-分泌酶抑制剂（γsecretase inhibitor，DAPT）可间接抑制γ-分泌酶底物Notch的活性，进而影响肺上皮细胞信号传导和肺上皮细胞分化。Notch信号是形成EMT的重要通路［8］。本实验旨在探讨DAPT能否阻断、逆转或部分逆转转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导的EMT，为肺纤维化相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 肺腺癌上皮细胞株A549购自上海赛百慷公司，在武汉大学典型培养物保藏中心-80℃冻存后保存于液氮罐中；TGF-β1购自美国Pepro Tech公司；DAPT购自美国Selleckchem公司；胎牛血清购自四季青公司；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；兔抗人E-钙黏合素（Ecadherin）、α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）购自美国Abcam公司；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；反转录试剂盒购自Thermo Scientific公司；Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）荧光定量试剂盒购自Takara公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；BCA试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养、分组及形态观察 将A549细胞用完全培养基（含10%胎牛血清、青霉素100 mg/L、链霉素100 U/mL的RPMI 1640培养基），置于37℃、5%CO2的培养箱内培养。将等量（1×105/mL）细胞接种于6孔板中，待细胞融合至60%时，再用不含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养24 h。对照组：用RPMI 1640完全培养基培养；TGF-β1组：在含有10μg/L TGF-β1的RPMI 1640培养基中培养；TGF-β1+DAPT组：在含有10μg/L TGF-β1和2μmol DAPT的RPMI 1640培养基中培养；DAPT组：在含有2μmol DAPT的RPMI 1640培养基中培养。每组细胞设置3个复孔，隔天换液，加入干预后48 h于倒置显微镜（×400）观察细胞形态变化。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测E-钙黏合素及α-SMA的mRNA表达 提取上述4组细胞总RNA，并测定RNA浓度。进行qPCR反应，重复3次实验，取平均值。用Trizol法提取总RNA，按反转录试剂盒说明操作合成cDNA。反应条件：42℃60 min，70℃10 min。反应体系（20μL）：RNA反应Mix 12μL，RNA样品4μL，无酶水4μL。反应结束后将cDNA稀释10倍，按照SYBR Green荧光定量试剂盒说明操作进行荧光定量PCR检测。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，序列见表1。反应体系（20μL）：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA模板2μL，灭菌水6μL。反应条件：95℃2 min；95℃15 s，60℃30 s，72℃15 s，40个循环。以β-actin为内参，以2－ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 Western blot检测各组细胞E-钙黏合素及α-SMA的表达 收集1.2.1各组细胞，使用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，按BCA试剂盒操作步骤进行蛋白定量，每个泳道加入50μg蛋白样品，根据蛋白分子量配制10%的PAGE胶电泳。电泳后将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜（1∶10 000稀释的E-钙黏合素、α-SMA，1∶1 000稀释GAPDH），TBST充分洗涤PVDF膜3～4次，二抗（1∶10 000）室温孵育2 h，ECL法发光显影，用Image J软件将E-钙黏合素、α-SMA分别与GAPDH灰度值标准化之比作为其蛋白表达的半定量结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞形态学结果比较 对照组细胞呈多边形，铺路石样，细胞间连接紧密。与对照组比较，TGF-β1组细胞的形态发生了明显改变，细胞拉长变成梭形，类似于纺锤体状且细胞间连接减少。TGFβ1+DAPT组仅有极少数细胞呈梭形，多数细胞形态和对照组相似。而DAPT组形态与对照组大致一致，见图1。

2.2 各组E-钙黏合素及α-SMAmRNA表达水平比较 与对照组比较，TGF-β1组E-钙黏合素mRNA相对表达水平降低，α-SMAmRNA相对表达水平增加（P＜0.05）；TGF-β1+DAPT组和DAPT组E-钙黏合素及α-SMAmRNA相对表达水平差异无统计学意义。与TGF-β1组比较，TGF-β1+DAPT组E-钙黏合素mRNA相对表达水平增加，α-SMAmRNA相对表达水平降低（P＜0.05），见表2。

Fig.1 Comparison of cell morphology between the four groups(Bar=20μm)图1 倒置显微镜下各组细胞形态的比较（Bar=20μm）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of E-cadherin andα-SMA mRNA between the four groups表2各组细胞E-钙黏合素和α-SMA mRNA相对表达水平比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of E-cadherin andα-SMA mRNA between the four groups表2各组细胞E-钙黏合素和α-SMA mRNA相对表达水平比较 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与TGF-β1组比较，P＜0.05。

组别对照组TGF-β1组TGF-β1+DAPT组DAPT组F E-钙黏合素0.997±0.149 0.044±0.036a 0.802±0.093b 1.026±0.168b 14.254＊α-SMA 1.045±0.174 1.863±0.095a 1.369±0.149b 1.075±0.065b 26.142＊

2.3 各组E-钙黏合素及α-SMA蛋白表达水平比较 与对照组比较，TGF-β1组E-钙黏合素蛋白相对表达水平降低，α-SMA蛋白相对表达水平增加（P＜0.05）；TGF-β1+DAPT组和DAPT组E-钙黏合素及α-SMA蛋白相对表达水平差异无统计学意义。与TGF-β1组比较，TGF-β1+DAPT组E-钙黏合素相对表达水平增加，α-SMA蛋白相对表达水平降低（P＜0.05），见图2、表3。

Fig.2 Western blot assay of E-cadherin andα-SMA图2 E-钙黏合素和α-SMA蛋白的Western blot图

Tab.3 Comparison of proteins of E-cadherin and α-SMA between the four groups表3 各组细胞E-钙黏合素和α-SMA蛋白相对表达水平比较 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of proteins of E-cadherin and α-SMA between the four groups表3 各组细胞E-钙黏合素和α-SMA蛋白相对表达水平比较 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与TGF-β1组比较，P＜0.05。

组别对照组TGF-β1组TGF-β1+DAPT组DAPT组F E-钙黏合素0.551±0.052 0.286±0.023a 0.497±0.057b 0.590±0.059b 22.121＊α-SMA 0.357±0.037 0.647±0.042a 0.484±0.049ab 0.380±0.040b 29.753＊

3 讨论

肌成纤维细胞（MFb）的活化与增生是肺纤维化特征性的病理生理过程，大量的肌纤维母细胞堆积并过分产生细胞外基质是肺纤维化形成和发展的原因［9-10］。在肺纤维化发病过程中，多数病理性的MFb是通过EMT转分化而来［11-12］。EMT表现为上皮细胞向间质细胞进行转化，其中上皮细胞标志物E-钙黏合素表达降低，间质标志物波形蛋白（vimentin）表达升高，而α-SMA作为间质标志物可用于评价EMT［13-14］。TGF-β1可以诱导肺上皮细胞向肺间质细胞转化［15-16］。本研究结果显示，与对照组比较，TGF-β1组E-钙黏合素蛋白和mRNA相对表达水平降低、α-SMA蛋白和mRNA相对表达水平增加，表明TGF-β1处理后可显著抑制A549细胞中肺上皮细胞标志物E-钙黏合素mRNA及蛋白表达，而促进肺间质细胞标志物α-SMA mRNA及蛋白的表达。另外，与对照组比较，TGF-β1组细胞的形态发生了明显改变，细胞拉长变成梭形，类似于纺锤体状且细胞间连接减少，表明TGF-β1可促使EMT从而导致肺纤维化。

Notch信号通路在肺组织生长发育、细胞分化中起着重要作用［17-18］。有研究显示，使用Notch信号阻断剂DAPT干预后，TGF-β1诱导的肺上皮细胞与正常肺上皮细胞无明显变化，细胞外基质亦无明显增加，说明Notch信号可促进细胞外基质的分泌［19］。Notch信号通路极有可能作为TGF-β1的一个下游因子参与了其诱导的EMT。本研究结果亦显示，Notch信号通路经特异性抑制剂DAPT干预后，肺上皮细胞株A549细胞维持典型的铺路石样形态，部分逆转TGF-β1诱导的细胞形态改变，并可促进肺泡上皮细胞标志物E-钙黏合素mRNA及蛋白的表达，抑制间质细胞标志物α-SMA mRNA和蛋白的表达，再次证实Notch信号通路抑制剂DAPT能够从基因和蛋白水平阻断TGF-β1诱导的A549细胞的形态改变、E-钙黏合素减少、α-SMA增加等变化，即有效逆转EMT。

综上所述，Notch信号特异性阻断剂DAPT很可能是抑制肺泡上皮细胞转分化为间质细胞的关键因素，其可作为一种有效的药物来抑制EMT，治疗肺纤维化或抑制肺纤维化的发生，为临床治疗肺纤维化带来新的希望。