慢病毒转染调控FoxM1表达对人肝内胆管细胞癌增殖、侵袭及MMPs表达的影响

刘凌云，毛涵，朱袭嘉

在人类肝脏原发肿瘤中，肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）发病率仅次于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），占肝脏原发恶性肿瘤的10%～15%［1］。全球范围内ICC发病率及病死率呈快速增长趋势［2］。由于ICC恶性程度高，根治性切除术后患者的5年生存率仅为20%～40%［3］。叉头盒蛋白M1（forkhead box protein M1，FoxM1）是叉头基因家族成员，人类FoxM1基因位于染色体12p13.3末端着丝粒区域，长约25 kb，包括10个外显子。FoxM1在细胞由G1期至S期分化过程中及保持染色体稳定性方面起到关键作用，是调节细胞增殖和凋亡的重要转录因子［4］。FoxM1可通过增强细胞增殖能力促进肿瘤形成，而且在晚期肿瘤中促进肿瘤侵袭和转移［5］。目前研究发现FoxM1在多种实体瘤中高表达，如乳腺癌［6］、HCC［7］及胃癌［8］等，并且与其预后、复发及转移相关。然而，FoxM1在ICC中的作用及机制尚未完全清楚。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是锌钙依赖肽链内切酶家族成员，其中MMP-9和MMP-2与肿瘤转移密切相关［9］。阻断FoxM1信号转导能通过抑制MMP-2表达，从而降低肝细胞癌干细胞样细胞的迁移和侵袭［10］。目前MMP-9和MMP-2在ICC中的作用尚不十分清楚，探索其对ICC的影响及是否与FoxM1相互关联具有重要意义。本研究利用慢病毒载体转染ICC细胞株，构建FoxM1上调及下调的稳定转染细胞株，并观察FoxM1表达变化对ICC细胞生物学行为及MMP-9和MMP-2表达的影响，为临床ICC的诊治奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人ICC细胞株HCCC-9810、RBE和SSP-25（中国科学院上海生命科学研究院）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国Life Technologies公司）；LV-FoxM1-RNAi、FoxM1过表达慢病毒、聚凝胺（中国吉凯基因公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus，货号RR820A，日本TaKaRa公司）；RIPA蛋白提取试剂盒、PMSF蛋白酶抑制剂、BCA蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物科技公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（美国Millipore公司）；FoxM1兔抗人多克隆抗体（英国Abcam公司）；MMP-9及MMP-2兔抗人多克隆抗体（美国Proteintech公司）；山羊抗兔二抗、GAPDH抗体（北京博奥森生物有限公司）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（南京凯基生物科技公司）；Transwell小室（美国Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将复苏的HCCC-9810、RBE和SSP-25细胞分别置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行常规的细胞培养和传代。

1.2.2 Western blot检测ICC细胞系FoxM1及MMP-9、MMP-2蛋白表达 收集各种生长状态良好的ICC细胞，加入RIPA和PMSF提取总蛋白，然后BCA法检测总蛋白含量，将已定量的总蛋白液与加样缓冲液以5∶1比例混合，经蛋白变性后制成待检测样品。配制5%浓缩胶和10%分离胶，将蛋白质样品加入各孔道配平，进行SDS-PAGE电泳。电泳产物以恒压电转至PVDF膜（80 V 30 min，110 V 60 min），室温下用5%蛋白封闭液于摇床上缓慢封闭2 h，用TBST漂洗后加入稀释的一抗（FoxM1、MMP-9、MMP-2：1∶1 000；GAPDH：1∶2 000）低速水平摇床上4℃孵育过夜，次日TBST漂洗后加入稀释的山羊抗兔二抗（1∶10 000），室温低速摇床孵育1 h，洗膜后滴加配好的ECL化学发光液曝光成像。以GAPDH为内参，图像处理软件Image J对蛋白条带进行半定量分析。

1.2.3 慢病毒转染ICC细胞株 慢病毒载体带有绿色荧光蛋白基因和嘌呤霉素抗性等特征，即转染成功后的细胞可以正常表达绿色荧光并对嘌呤霉素耐药。按照慢病毒转染手册，转染前24 h，选取生长状态良好的目标细胞，常规培养条件下，24孔板每孔加入（2～10）×104个细胞进行培养。24 h后细胞融合率达到70%～90%时，吸除旧培养基，每孔加入0.5 mL悬浮稀释的慢病毒（5～8 mg/L，已加入含有聚凝胺的无血清RPMI 1640培养基，分为上调组HCCC-9810-FoxM1及下调组SSP-25-shFoxM1），同时以对照阴性慢病毒（加有聚凝胺）转染目的细胞建立对照组细胞株（分为HCCC-9810-Control组及SSP-25-Control组），细胞常规于37℃、5%CO2培养箱培养。转染后12 h观察细胞生长状态，如无明显毒性作用，约48 h后更换常规培养基。转染后96 h可在倒置相差荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况。细胞绿色荧光蛋白表达亮度较好并生长稳定情况下，加入嘌呤霉素（1 mg/L）筛选去除转染差的细胞，Western blot检测各组转染后细胞中FoxM1蛋白表达变化情况，细胞荧光高表达及生长稳定后可继续培养进行后续细胞实验。

1.2.4 MTT法检测转染后各组ICC细胞增殖力 取各组对数生长期的细胞计数，96孔板中每孔加入（5～10）×103个细胞（100μL），边缘孔加入无菌PBS液，每组细胞设5个平行对照孔，5%CO2、37℃条件下培养，倒置显微镜观察48 h和72 h细胞生长情况。实验结束前4 h加入5 g/L MTT液10μL，继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入200μL DMSO，37℃摇床震荡10 min，待结晶充分溶解后在酶标仪上检测490 nm波长下每孔的光密度（OD）值，绘制生长曲线。

1.2.5 Transwell实验检测FoxM1对ICC细胞侵袭的影响 将预冷的RPMI 1640无血清培养基与Matrigel Matrix基质胶按体积比1∶8比例充分混匀稀释，每孔加入50μL上述稀释液至小室聚碳酸酯膜（小室底膜）的上室面，37℃培养箱中放置4 h使其聚合成凝胶。上室加入准备好的细胞悬液（HCCC-9810组，1×105个/孔，100μL；SSP-25组，5×104个/孔，50μL）。下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。种板时需避免产生气泡，常规细胞培养48 h后取出小室，用棉签头轻柔擦掉小室上层细胞，4%多聚甲醛固定小室30 min，再用0.1%结晶紫染色30 min，PBS洗净风干后显微镜下随机读取5个视野（上、中、下、左及右）小室下表面细胞计数并拍照。该实验同样条件下重复3次。

1.2.6 qPCR检测FoxM1变化对ICC细胞MMP-9及MMP-2 mRNA表达的影响 收集各组对数生长期细胞，用Trizol法提取其总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。取逆转录产物2μL，总体系20μL，使用TaKaRa公司SYBR Green染料法进行qPCR反应，GAPDH为内参，反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。使用NCBI在线Primer Blast设计引物，反应体系中引物序列见表1。每个样本均设3个复孔，重复3次取平均值。记录各阶段Ct值，用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

Tab.1 qPCR sequence of primers表1 qPCR检测引物序列

1.3 统计学方法 使用GraphPad Prism 6.0和SPSS 20.0软件包进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用配对t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICC细胞株中FoxM1蛋白表达情况 Western blot检测3种ICC细胞株HCCC-9810、RBE和SSP-25的FoxM1蛋白表达水平分别为0.24±0.05、0.82±0.04、1.74±0.10（F=347.600，P＜0.01），SSP-25细胞株表达最高，HCCC-9810表达最低，见图1。

Fig.1 Expression levels of FoxM1 protein in ICC cell lines图1 ICC细胞株中FoxM1蛋白表达情况

2.2 ICC稳定转染细胞株的建立及鉴定 选取HCCC-9810作为上调FoxM1目标细胞株（HCCC-9810-FoxM1组），SSP-25作为下调FoxM1目标细胞株（SSP-25-shFoxM1组）。2株细胞转染效率均达90%以上，进一步使用添加嘌呤霉素的RPMI 1640培养基（1 mg/L）筛选，2株细胞均能持续表达绿色荧光蛋白且生长状态良好，见图2。Western blot检测结果提示HCCC-9810-FoxM1组较HCCC-9810-Control组FoxM1表达稳定上调（1.53±0.11vs.0.38±0.05，t=13.990，P＜0.01），而SSP-25-shFoxM1组较SSP-25-Control组FoxM1表达稳定下调（0.20±0.05vs.0.87±0.07，t=10.480，P＜0.01），见图3。

Fig.2 Representative graph of green fluorescent protein expression in ICC cell lines after lentivirus transfection图2 慢病毒转染后ICC细胞株绿色荧光蛋白表达图

Fig.3 Expression of FoxM1 in ICC stably transfected cell lines图3 ICC稳定转染细胞株FoxM1表达情况

2.3 ICC细胞增殖能力比较 MTT实验结果显示，实验开始48 h后HCCC-9810-FoxM1组增殖能力明显高于HCCC-9810-Control组，而SSP-25-shFoxM1组增殖能力明显低于SSP-25-Control组（均P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of the proliferation ability between the four groups of ICC cells表2 各组ICC细胞增殖能力对比（n=3，OD490，±s）

Tab.2 Comparison of the proliferation ability between the four groups of ICC cells表2 各组ICC细胞增殖能力对比（n=3，OD490，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别HCCC-9810-Control组HCCC-9810-FoxM1组t SSP-25-Control组SSP-25-shFoxM1组t 24 h 0.36±0.01 0.34±0.02 1.107 0.35±0.01 0.36±0.01 0.725 48 h 0.76±0.07 1.07±0.10 4.544＊0.81±0.06 0.59±0.06 3.908＊72 h 1.21±0.08 2.08±0.08 11.322＊＊1.65±0.09 1.02±0.09 7.288＊＊

2.4 FoxM1表达变化影响ICC细胞的侵袭能力 Transwell小室侵袭实验结果表明，HCCC-9810-FoxM1组的穿透细胞数目明显高于HCCC-9810-Control组（单 位：个/视 野，394.00±9.64vs.219.00±12.53，t=21.650，P＜0.01）；而 SSP-25-shFoxM1组穿透细胞数目明显低于SSP-25-Control组（197.00±10.58vs.463.67±20.50，t=32.000，P＜0.01），见图4。

Fig.4 Transwell cell invasion test(×100)图4 Transwell小室侵袭实验（×100）

2.5 FoxM1表达变化影响ICC细胞MMP-9及MMP-2 mRNA表达 HCCC-9810-FoxM1组中MMP-9及MMP-2 mRNA表达水平较HCCC-9810-Control组明显升高，而SSP-25-shFoxM1组中MMP-9及MMP-2 mRNA表达水平较SSP-25-Control组明显降低（均P＜0.01），见表3。

3 讨论

ICC的生物学行为较HCC更具侵略性，预后较HCC更差［11］。而ICC肝切除术后复发及转移是导致ICC术后生存率低的主要因素［3，12］。目前，由于缺乏敏感性和特异性高的生物标志物，ICC早期诊断困难［11］，从而直接影响ICC的后续治疗及预后。因此，寻找有效的生物标志物，对于提高ICC早期诊断率及疗效具有重要的临床意义。

Tab.3 Effects of FoxM1 expression changes on the relative expression levels of MMP-9 and MMP-2 mRNA in ICC cells表3 FoxM1表达变化对ICC细胞MMP-9及MMP-2 mRNA相对表达量的影响 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of FoxM1 expression changes on the relative expression levels of MMP-9 and MMP-2 mRNA in ICC cells表3 FoxM1表达变化对ICC细胞MMP-9及MMP-2 mRNA相对表达量的影响 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

组别HCCC-9810-Control组HCCC-9810-FoxM1组t SSP-25-Control组SSP-25-shFoxM1组t MMP-9 1.08±0.12 2.29±0.25 10.464＊＊1.05±0.05 0.47±0.01 10.521＊＊MMP-2 1.00±0.09 2.40±0.31 15.640＊＊1.04±0.03 0.53±0.08 15.992＊＊FoxM1 1.05±0.11 2.71±0.28 15.044＊＊1.03±0.04 0.27±0.11 18.603＊＊

FoxM1在恶性肿瘤细胞发生、增殖和侵袭转移等方面发挥重要作用。一项研究通过siRNA干扰非浆液性上皮性卵巢癌细胞株FoxM1表达，发现下调FoxM1表达可抑制肿瘤细胞生长和克隆形成［13］。另一项研究报道FoxM1影响HCC组织染色体稳定性，在HCC发生发展中起到促进作用［14］。Yu等［15］发现FoxM1在高转移潜能HCC细胞MHCCLM3中的表达较低转移潜能细胞SMMC7721明显升高，并且与HCC细胞迁移及侵袭密切相关，从而促进HCC转移。FoxM1在多种恶性肿瘤包括HCC的发生发展及侵袭转移等演进过程中具有重要作用，深入研究其特点及机制具有重要价值。而目前FoxM1影响ICC细胞恶性表型方面的功能尚不清楚，在ICC细胞的增殖、侵袭转移方面的作用机制尚需进一步阐明。

本研究首先运用Western blot技术分别检测3种ICC细胞株中FoxM1蛋白表达水平，发现SSP-25细胞株中FoxM1表达最高，HCCC-9810中表达最低，决定选取HCCC-9810作为上调FoxM1细胞株，SSP-25作为下调FoxM1细胞株。笔者选用目前已经广泛使用且稳定性高、特异性强的慢病毒载体作为FoxM1转染实验手段，经过反复实验及摸索最佳转染条件，成功建立了FoxM1稳定转染ICC细胞株。随后经Western blot验证，HCCC-9810-FoxM1、SSP-25-shFoxM1及两种相应对照细胞株HCCC-9810-Control、SSP-25-Control均能持续稳定表达FoxM1，且HCCC-9810-FoxM1上调FoxM1表达明显，SSP-25-shFoxM1则下调明显，达到后续实验要求。接下来一系列体外细胞功能实验证实，过表达HCCC-9810-FoxM1细胞较Control组细胞在增殖及侵袭能力上明显增强，而下调FoxM1表达的SSP-25-shFoxM1细胞较Control组细胞在增殖及侵袭能力上明显降低。上述实验结果表明FoxM1能够体外促进ICC细胞生长增殖及转移。

研究表明，下调FoxM1表达降低了MMP-9及MMP-2的表达和活性，从而抑制了肾透明细胞癌的迁移及侵袭［16］。本研究发现，FoxM1过表达增强ICC细胞侵袭能力，而MMP-9和MMP-2表达增加，表明MMP-9及MMP-2表达变化可能在FoxM1参与调控ICC侵袭过程中起到一定作用，但MMP-9和MMP-2表达是否为FoxM1直接调控或者是间接控制，目前尚不明确。

综上，本研究初步阐明了FoxM1在ICC中上调可明显增强ICC细胞增殖及侵袭能力，而下调FoxM1表达可显著抑制其增殖及侵袭能力，FoxM1可能促进ICC中MMP-9及MMP-2表达，促进ICC增殖及侵袭，并可能通过MMP-9及MMP-2起作用，但相关具体机制尚需进一步研究。FoxM1有望成为ICC新的生物标志物及ICC治疗的新靶点。本研究为揭示ICC发生发展的分子机制提供了一定的理论基础，并为探索ICC有效的诊治策略提供了新思路。