基于ITS2 DNA序列的雷公藤属药材资源谱系地理学研究

励 娜，王 丹，陈一龙，姚媛媛，张小梅*，李胜容*

基于ITS2 DNA序列的雷公藤属药材资源谱系地理学研究

励 娜1, 2，王 丹1, 2，陈一龙1, 2，姚媛媛3，张小梅1, 2*，李胜容1, 2*

1. 重庆市中药研究院，重庆 400065 2. 重庆市中药研究院 重庆市中药药学评价工程技术研究中心，重庆 400065 3. 嘉兴学院生物与化学化工学院，浙江 嘉兴 314001

采用ITS2 DNA条形码技术，研究雷公藤属3种药用植物的遗传特性，揭示其地理分布格局的形成原因。收集雷公藤属植物28个居群223份样本，提取基因组DNA，扩增ITS2基因序列并测序，并进行遗传多样性分析，绘制失配分布曲线检测群居历史动态变化情况，估算雷公藤属种间、种内群体间和群体内的差异及遗传分化系数。雷公藤属28个居群223份样本共检测到12个碱基突变位点，构成10个单倍型。昆明山海棠共有7个单倍型，H2～H7为特有单倍型；雷公藤共有4个单倍型，H8为特有单倍型；东北雷公藤共有3个单倍型，无特有单倍型；H1为3个物种间的共有单倍型，H9和H10为雷公藤和东北雷公藤共有单倍型。群体遗传多样性分析显示，雷公藤属具有较高的单倍型多态性（d＝0.615±0.024）和核苷酸多态性[i＝（9.47±0.58）×10−3]。群体遗传结构分析显示，雷公藤属的变异主要存在于物种之间（76.14%），种内群体间和群体内的变异分别为11.42%、12.44%。群体动态历史分析表明，雷公藤属、雷公藤和东北雷公藤曾经历过扩张，而昆明山海棠未经历过扩张。雷公藤属及其属下的昆明山海棠和雷公藤的遗传多样性水平较高，而东北雷公藤遗传多样性水平较低。雷公藤属植物在第4纪冰期时，将中国西南、华中和华东的部分地区作为冰期避难所，冰期后以冰期避难所为中心向四周扩散，形成当前雷公藤属植物的分布格局。

雷公藤属；昆明山海棠；雷公藤；东北雷公藤；ITS2序列；谱系地理学；遗传特性

第4纪冰期的气候震荡显著改变了北半球温带地区的大多数物种的地理分布，产生了不同程度的范围扩展和收缩，影响了种群内部和种群间遗传变异的地理格局[1-2]。近年，基于DNA条形码技术的分子谱系地理学是国际上研究居群遗传分化进化历史的热点和亮点[3]。分子谱系地理学研究技术在药用植物遗传多样性、历史进化、地理分布格局历史成因和资源保护等方面的研究中发挥着日益重要的作用[4-5]。ITS2基因序列常用于植物属间、种间甚至居群间的系统关系探究，对于植物居群的动态结构、历史事件的发生过程有清晰的认识，能全面的反应居群的进化历史[6-7]。

我国传统药用植物昆明山海棠(Lévl.) Hutch.和雷公藤Hook均属于卫矛科（Celastraceae）雷公藤属L.植物，同属植物还包括东北雷公藤Sprague et Takeda，其中前两者广泛分布于我国长江中、下游以南及西南地区，后者主要分布于我国东北地区[8]。作为自身免疫性疾病临床常用中药，昆明山海棠与雷公藤植物药材目前主要采自野生，经过近30年的开发利用和适生环境被侵占，呈现资源锐减、供应严重匮乏等现象，甚至部分地区面临资源枯竭的危险[9-10]。因此，本研究旨在通过分析我国雷公藤属植物28个居群223份个体的ITS2的序列变异，阐明雷公藤属植物遗传特性及地理分布格局的历史成因，以期为该属植物的资源保护策略的制定提供一定的参考。

1 材料

1.1 药材

本研究共收集3种雷公藤属植物28个居群223份样本，经重庆市中药研究院瞿显友研究员分别鉴定为昆明山海棠(Lévl.) Hutch.、雷公藤Hook和东北雷公藤Sprague et Takeda的干燥根。具体信息见表1。

表1 样品来源

Table 1 Source of samples

编号品种产地海拔/m经度纬度 S1昆明山海棠四川米易普威2226E101°59′31″N27°03′33″ S2四川米易横山1824E102°00′40″N26°59′26″ S3四川德昌1772E102°08′21″N27°23′44″ S4四川冕宁林里1624E102°11′57″N28°22′43″ S5四川冕宁石龙1840E102°12′14″N28°31′21″ S6云南南华2507E101°01′23″N25°19′30″ S7云南大理2450E100°07′31″N25°41′59″ S8云南南涧1696E100°32′51″N24°48′37″ S9云南保山2280E99°06′58″N25°07′30″ S10贵州雷山1160E108°13′43″N26°25′07″ S11贵州剑河 811E108°33′18″N26°37′58″ S12贵州印江 873E108°36′48″N27°56′27″ S13重庆武隆1589E107°42′24″N29°30′23″ S14重庆石柱1580E108°23′01″N30°13′23″ S15重庆江津1164E106°26′06″N28°36′21″ S16湖南南岳 764E112°38′18″N27°14′06″ S17湖南新宁1094E110°54′04″N26°26′07″ S18湖南武冈1415E110°37′21″N26°39′02″ S19湖北利川 738E108°39′50″N30°25′25″ S20雷公藤湖北通城 152E113°45′37″N28°07′20″ S21浙江龙泉1208E118°58′14″N28°05′21″ S22江西湾里 168E115°43′10″N28°48′29″ S23江西婺源 60E117°32′45″N29°05′40″ S24江西修水 152E114°02′41″N28°55′40″ S25东北雷公藤吉林通化 650E126°04′26″N41°34′02″ S26吉林江源1024E126°42′09″N41°55′39″ S27吉林临江 739E126°55′20″N41°50′11″ S28吉林池北1090E128°10′59″N42°11′07″

1.2 试剂与仪器

植物基因组DNA试剂盒，天根生化科技有限公司；TIANGel Midi纯化试剂盒，天根生化科技有限公司；UV-1100 SPECTROPHOTMETER，MAPADA有限公司；BP121S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；AEG-45SM型电子天平，日本岛津公司；BJ-100型多功能粉碎机，德清拜杰电器有限公司；KQ250DB型数控超声波清洗器，巩义市予华仪器有限公司；HH-S24型恒温水浴锅水浴锅，金坛梅香仪器有限公司；SCIENTZ-48 DNA提取研磨机；9700 GeneAmp PCR仪，Applied Biosystems公司；ABI 3730XL测序仪，Applied Biosystems公司。

2 方法

2.1 DNA提取、扩增和测序

根据植物基因组DNA试剂盒说明书提取上述28个居群223份雷公藤属植物样本总基因，参考Chen等[11]操作步骤进行PCR扩增。ITS2引物序列：正向为5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’；反向为5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。采用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，并使用TIANGel Midi试剂盒进行纯化。使用ABI 3730XL测序仪对纯化后的样品进行测序。

2.2 遗传多样性分析

使用DnaSP v5软件确定雷公藤属3个物种28个居群ITS数据的单倍型，并统计多态位点和信息位点的数目，计算群体单倍型多样性（haplotype diversity，d）、核苷酸多样性（nucleotide diversity，i）。

2.3 群体遗传结构分析

使用PERMUT软件计算雷公藤属的遗传分化参数（st、st），并检验差异的显著性。使用Arlequin3.5软件进行分子方差分析（AMOVA）估算属内种间、种内群体间和群体内的差异，以及种间和群体间遗传分化系数。

2.4 中性检验

使用DnaSP v5软件计算中性检验统计值Tajima’s（值）和Fu’（值）。中性学说认为分子水平上的突变大多是中性或接近中性，对生物体的生存不存在任何有利或不利影响，且不受自然选择的影响。突变是自然种群随机遗传漂变的结果，因此，核酸替换率只与它的突变率相关，它们概率是相等的。通过检验来判断这些位点是否符合中性进化模式。如果值为负值，说明种群内存在大量低频率的等位基因，暗示着种群曾经经历过扩张和或净化选择；如果值为正，则说明种群内中等频率的等位基因较多，那么种群可能经历过瓶颈效应和或平衡选择。值亦如此。但是值反映的是群体动态的古老事件，而值反映的则是近期发生的群体动态。

2.5 失配分析

失配分布是检测群体大小变化的一种方法，可以推测群体是否经历过快速扩张事件。失配分布检验主要是将种群中的任意两个序列进行比较进而得到两个序列间差异的分布情况，其结果可用于计算雷公藤属各水平类群在历史上的种群动态。通过观察值与模拟值间的离差平方和和反映拟合曲线平滑度的RAG值，可以判断雷公藤属种群是否经历过种群扩张或是瓶颈效应。因为种群大小如果长期保持稳定的话，那么它的分布曲线应该出现至少2个峰值，而经历过快速扩张的种群则会呈现为泊松分布。用DnaSP v5软件绘制失配分布曲线，用Arlequin 3.5计算相关参数。

2.6 单倍型网络图分析

以独子藤Roxb.作为外类群，利用Network构建基于Median joining算法的单倍型网络图，并对该图进行手工调整。

2.7 单倍型系统发育树

使用Modeltest 3.7软件对ITS2单倍型序列进行计算，以得到DNA序列替代模型的最佳模型。利用MrBayes 3.1.2软件对ITS2序列数据进行贝叶斯分析，构建以独子藤为外类群的雷公藤属的单倍型系统树。

3 结果与分析

3.1 ITS2序列变异分析和单倍型分布

雷公藤属3个物种28个群体223份样本成功扩增出223 bp ITS2序列，共检测到12个变异位点（Variable/polymorphic sites），全为碱基突变，共有11个信息位点（parsimony informative sites）（表2）。12个变异位点构成了10个单倍型（H1～H10）。昆明山海棠共有7单倍型，其中6个为特有单倍型（H2～H7）；雷公藤共有4单倍型，其中1个为特有单倍型（H8）；东北雷公藤共有3单倍型，无特有单倍型；3个物种之间，H1是3个物种共有单倍型，H9和H10为雷公藤和东北雷公藤共有单倍型；除开H1，东北雷公藤和昆明山海棠之间、昆明山海棠和雷公藤之间再无其他共有单倍型（表3）。

表2 雷公藤属10种单倍型和12个变异位点

Table 2 Ten haplotypes and 12 variant sites of Tripterygium

类型变异位点 123456789101112 H1GGAAGTCATCCT H2−A−−−−−−−−−− H3−−−−−−−−−−T− H4A−−−−−T−−−−− H5−−−−−−T−−−−− H6−−−−−CT−−−−− H7−−−−−C−−−−−− H8−−G−−−−−−−−− H9−−−T−−−GCT−A H10−−−−A−−−−−−−

表3 雷公藤属物种的单倍型多态性、核酸多态性和单倍型分布

Table 3 Haplotype polymorphism, nucleic acid polymorphism and haplotype distribution in Tripterygium

编号单倍型数量HdPi /(×10−3)单倍型种类及频次 S01130.410±0.154 1.95±0.90H1(10)、H2(2)、H3(1) S02120.485±0.106 2.17±0.48H1(8)、H2(4) S03 90.000±0.000 0.00±0.00H1(9) S04120.000±0.000 0.00±0.00H1(12) S05 70.000±0.000 0.00±0.00H1(7) S06100.000±0.000 0.00±0.00H1(10) S07110.327±0.153 2.94±1.38H1(9)、H4(2) S08110.000±0.000 0.00±0.00H1(11) S09110.000±0.000 0.00±0.00H1(11) S10110.000±0.000 0.00±0.00H5(11) S11110.000±0.000 0.00±0.00H5(11) S12 50.000±0.000 0.00±0.00H5(5) S13120.485±0.106 2.17±0.48H1(4)、H2(8) S14130.000±0.00 0.00±0.00H5(13) S15120.409±0.133 1.83±0.60H1(3)、H5(9) S16120.000±0.000 0.00±0.00H1(12) S17 60.000±0.000 0.00±0.00H1(6) S18 31.000±0.272 5.98±1.99H1(1)、H6(1)、H7(1) S19 60.000±0.000 0.00±0.00H1(6) S20 80.000±0.000 0.00±0.00H1(8) S21100.000±0.000 0.00±0.00H8(10) S22150.590±0.07712.13±1.55H1(8)、H9(6)、H10(1) S23100.000±0.000 0.00±0.00H1(10) S24 90.000±0.000 0.00±0.00H1(9) S25100.000±0.000 0.00±0.00H9(10) S26180.000±0.000 0.00±0.00H9(18) S27200.468±0.10410.36±2.12H1(5)、H9(14)、H10(1) S28180.000±0.000 0.00±0.00H9(18)

3.2 群体遗传多样性分析

雷公藤属28个群体共检测到12种单倍型，每个群体的单倍型及个体数见表3。在28个群体中，8个群体具有单倍型多态性，其中4个群体具有2种单倍型，4个群体具有3种单倍型，无群体具有3个以上的单倍型。如表4所示，雷公藤属具有较高的单倍型多态性（d＝0.615±0.024）和核苷酸多态性[（i＝9.47±0.58）×10−3]，在物种水平上3个物种的多态性水平均小于雷公藤属多态性水平，d的变化范围为（0.170±0.060）（东北雷公藤）～（0.506±0.069）（雷公藤），i的变化范围为（2.22±0.21）×10−3（昆明山海棠）～（6.26±1.51）×10−3（雷公藤）。群体水平上，d的变化范围为（0.327±0.153）（大理）～（1.000±0.272）（武冈），i的变化范围为（1.83±0.60）×10−3（江津）～（12.13±1.55）×10−3（南昌）。

表4 雷公藤属群体的单倍型多态性、核酸多态性和单倍型分布

Table 4 Haplotype polymorphisms, nucleic acid polymorphisms, and haplotype distribution in Tripterygium

样本单倍型数量HdPi/(×10−3) 昆明山海棠1870.448±0.0352.22±0.21 雷公藤 520.506±0.0696.26±1.51 东北雷公藤 660.170±0.0603.90±1.36 雷公藤属2230.615±0.0249.47±0.58

3.3 群体遗传结构

AMOVA分析显示，雷公藤属的变异主要存在于物种之间（76.14%），种内群体间和群体内的变异分别为11.42%、12.44%。物种水平上，雷公藤的变异在群体间和群体内差异不大，分别为47.66%和52.34%；昆明山海棠的变异主要存在于群体间（65.54%），群体内的变异为34.46%；东北雷公藤的变异主要存在于群体内（76.64%），群体间的变异为23.36%（表5）。

表5 雷公藤属分子变异分析(AMOVA)

Table 5 Molecular variation analysis of Tripterygium(AMOVA)

样本 变异来源自由度平方和变异百分比/%F值 雷公藤属物种间2211.05976.14FCT=0.761 36 种内群体间2554.11211.42FSC=0.478 64 群体内27755.68812.44FST=0.875 58 东北雷公藤群体间36.30823.36 群体内6221.95076.64FST= 0.233 61 昆明山海棠群体间1831.14265.54FST= 0.655 44 群体内16814.80534.46 雷公藤群体间416.66347.66FST= 0.476 56 群体内4718.93352.34

3.4 群体动态历史分析

分别在属水平、物种水平进行值和值中性检验（表6），结果显示值和值的正负不一，均未到达显著水平，因此不能拒绝中性假说。说明雷公藤属在属水平和物种水平均未经历过群体扩张或瓶颈事件。

分别对雷公藤属以及3个物种进行了失配分布检验（表6）。雷公藤属水平上，SSD＝0.072 78，＝0.19，RAG＝0.156 17，＝0.32，不能拒绝扩张假说。物种水平上，雷公藤和东北雷公藤的SSD和RAG的值都不显著，不能拒绝扩张假说；而昆明山海棠的SSD的值显著，RAG的值不显著，从SSD的结果看需要拒绝扩张假说，而从RAG的结果看，不能拒绝扩张假说，结果不一致。另外从失配分布曲线看，雷公藤属、雷公藤和东北雷公藤的观察曲线为双峰，而昆明山海棠呈现的是比较完整的单峰分布，说明雷公藤属、雷公藤和东北雷公藤曾经经历过扩张，而昆明山海棠未经历过扩张（图1）。

中性检验、失配分析的曲线以及SSD和RAG分析对雷公藤属、昆明山海棠、雷公藤和东北雷公藤的群体动态结果不一致，可能是由于ITS2一个片段的信息位点太少导致，需要进一步增加片段进行分析。

3.5 单倍型网络图分析

如图2所示，单倍型网络图分析显示雷公藤属的10个单倍型构成一个星状的拓扑结构，其中单倍型H1和H5处于星状结构的中心，与其他单倍型具有最近的亲缘关系，说明H1和H5是最原始的单倍型。根据星状的拓扑结构，雷公藤属10个单倍型大致可以分成3个支系，其中2个支系分别以H1和H5为祖先单倍型，H9单独成为一个分支构成一个支系。

结合单倍型分布图分析发现，单独为一个支系的单倍型H9为东北雷公藤独有单倍型，4个东北雷公藤群体均有该单倍型，因此H9的分布与东北雷公藤的分布范围一致，在我国东北部。以H5为祖先单倍型的支系，主要分布在云南北部、贵州、重庆南部和湖南西部地区，该支系为昆明山海棠所独有。剩余单倍型的以H1为祖先单倍型，雷公藤属的3个物种都有该支系的单倍型，分布范围最为广阔。

表6 雷公藤属中性检验和失配分析结果

Table 6 Tripterygium neutrality test and mismatch analysis results

样本SSDP值HRAGP值F值P值D值P值 雷公藤属0.072 780.190.156 20.32 0.812 360.692 0.249 730.638 雷公藤0.040 260.140.160 90.49 1.927 540.850−0.259 580.474 东北雷公藤0.033 030.060.717 60.67 1.917 660.819−0.748 920.249 昆明山海棠0.008 700.040.152 90.11−3.201 470.070−0.825 290.245

图1 雷公藤属失配分布分析

图2 雷公藤属单倍型网络局部图

3.6 单倍型系统发育树

使用贝叶斯法构建的雷公藤属系统发育树见图3，该系统树中多数分支的支持率很低，其中H5、H4和H6构成的分支的支持率超过0.5，与单倍型网络图结果相似。系统树中，H9依然是单独够成一支，与单倍型网络图的结果也类似。与单倍型网络图结果不一样的是在系统发育树中剩余单倍型并未独聚为一支，而是与H5、H4和H6一起构成一个支持率为0.53的分支，而H7和H8未与他们聚在一起。

图3 雷公藤属单倍型系统发育树

4 讨论

4.1 群体遗传多样性

在属水平上，雷公藤属具有较高的遗传多样性，d为0.615±0.024，i为（9.47±0.58）×10−3；物种水平上，雷公藤属3个物种遗传多样性水平具有一定的差异，其中d由高到低依次为雷公藤（0.506±0.069）、昆明山海棠（0.448±0.035）、东北雷公藤（0.170±0.060）；与雷公藤属属水平遗传多样性相比，物种水平的遗传多样性较低。雷公藤属及其属下2个种昆明山海棠和雷公藤的遗传多样性水平较高，而东北雷公藤遗传多样性水平较低。东北雷公藤遗传水平低的原因可能有2种，一个是第4纪冰期时，东北雷公藤已经扩散到我国东北地区，在冰期时群体收缩由于严重的遗传漂变导致群体遗传多样性下降。第2个是东北雷公藤在扩散到东北时，由于建群者效应导致当前的群体遗传多样性水平较低。

4.2 群体遗传结构

群体遗传结构方面，雷公藤属3个物种群体水平的遗传多样性都很低。属水平上，28个群体中只有8个群体具有遗传多样性。物种水平上，5个雷公藤群体只有1个群体具有遗传多样性，19个昆明山海棠群体只有6个群体具有遗传多样性，4个东北雷公藤群体只有1个群体具有遗传多样性。AMOVA分析显示，雷公藤属的变异主要存在于物种之间（76.14%），雷公藤属物种间分化显著。物种水平上，雷公藤的变异在群体间和群体内差异不大；昆明山海棠的变异主要存在于群体间；东北雷公藤的变异主要存在于群体内。Hamrick等[12]的研究认为，在物种水平上植物群体遗传多样性水平主要收到系统分类地位、分布范围、生活型、繁育系统和种子散播机制等因素的影响，群体水平上主要受到繁育系统、分布范围、生活史、分类地位和种子的散播机制等因素的影响。根据Hamrick和Godt理论，多年生、异交为主、风媒或水媒扩散种子的植物群体间的分化程度较低，相反长寿的、自交为主的植物群体间的分化程度较高。

4.3 冰期避难所

气候波动对植物地理分布格局的影响非常大，第4纪冰期是对当前我国植物地理分布格局影响最大的一次历史气候[13-14]。在第4季冰期时，亚洲、美洲和欧洲都有明显的大陆冰川，但是在我国范围内没有明显的大陆冰川，只有部分山地冰川[15]。冰期避难所是指在冰期尤其是盛冰期时，许多物种分布范围收缩后生存下来的区域[16]。避难所区域的群体比其他区域群体的遗传多样性高，根据这一特性及雷公藤属单倍型分布格局，认为在第4纪冰期时，云南北部及四川南部的横断山脉、重庆的大巴山脉、湖南南部的南岭和江西北部的庐山是雷公属植物的冰期避难所。

云南北部及四川南部地处我国横断山脉，横断山脉地区位于青藏高原东南部外围，地质构造上十分活跃。该区域具有复杂的种子植物区系和丰富的特有种，是潜在的第4季冰期避难所[17]。大巴山脉具有山高、坡陡、谷深的地貌特点。秦巴山地是北部冷空气南下的重要屏障，使得这一地区保存有第3纪植物最具丰富性和完整性[18]。周先容等[19-20]研究指出大巴山、武陵山、神农架地区具有较大比例的古特有属和珍稀濒危物种，无遗是古植物区系的重要避难所。南岭地区是热带和亚热带的过度地区，长期保持湿热的气候环境，对中生代和新生代的植物进化起着重要的作用。该区域中国特有种在总种数中占比高达59.9%，也是动植物第4纪冰期的避难所。周秉根等[21-22]对扬子鳄的研究认为第四纪冰期是华中地区的中低山系（包括黄山、庐山、九华山和天目山等）不具备发育冰川的条件，而是季风性冰缘环境且为温暖带气候，很可能是第4纪冰期避难所。

结合雷公藤属植物单倍型分布图和单倍型网络图分析发现，雷公藤属植物具有中国西南至华中，然后到华东，最后扩散到东北的历史迁移路线。笔者认为，雷公藤属植物在第4纪冰期时以云南北部及四川南部的横断山脉、重庆的大巴山脉、湖南南部的南岭和江西北部的庐山作为冰期避难所，冰期后以冰期避难所为中心向四周扩散，形成当前雷公藤属植物的分布格局。

4.4 资源状况分析

雷公藤属药用植物资源目前主要来自野生，其中昆明山海棠分布面积较雷公藤和东北雷公藤更广，野生资源较为丰富，在四川凉山等地成片生长，但由于过度开采及存在大量紫茎泽兰恶性竞争其适生环境，其蕴藏量已急剧减少。雷公藤多以散生为主，在本次实地取样过程种未见大面积群落，一个地方仅有几株、几十株，重复取样具有一定困难。且雷公藤喜阴湿，但需要一定阳光，郁闭度稍高，长势就变弱。现华东地区严禁砍伐木材后，山区森林郁闭度增高，雷公藤长势渐弱，进一步不利于雷公藤的生长繁殖。东北雷公藤的群落主要集中在长白山地区。由于其尚未开发利用，野生资源还未被破坏，但分布区较小，资源蕴藏总量不多。

综上所述，基于ITS2基因序列对雷公藤属药用植物谱系地理学研究结果表明，该属植物具有较高的遗传多样性，其下的3个物种群体水平的遗传多样性都很低。在第4纪冰期时以云南北部及四川南部的横断山脉、重庆的大巴山脉、湖南南部的南岭和江西北部的庐山作为冰期避难所，冰期过后以冰期避难所为中心向四周扩散，形成当前雷公藤属植物的分布格局。资源现状分析提示雷公藤属药用植物野生资源匮乏，后续课题组将就此进一步提出雷公藤属药用植物资源保护和可持续发展策略。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] Li Q E, Guo X, Niu J F,. Molecular phylogeography and evolutionary history of the endemic species(Papaveraceae) on the Tibetan Plateau inferred from chloroplast DNA and ITS sequence variation [J]., 2020, 11: 436.

[2] Hewitt G. The genetic legacy of the Quaternary ice ages [J]., 2000, 405(6789): 907-913.

[3] 卓维, 刘艳, 白娟, 等. 基于nrDNA ITS序列的榧树属植物鉴定及亲缘关系分析 [J]. 分子植物育种, 2021, 19(11): 3579-3587.

[4] 李菁, 向婷婷, 许成, 等. 分子谱系地理学在药用植物基因水平的研究进展 [J]. 中草药, 2015, 46(8): 1243-1246.

[5] 刘晓光, 黄璐琦, 袁庆军, 等. 基于分子谱系地理学的药用植物核心种质构建 [J]. 中国中药杂志, 2012, 37(5): 692-698.

[6] 杨俊誉, 魏世杰, 苏代发, 等. 云南黄毛草莓的nrDNA ITS和cpDNA psbA-trnH序列分子鉴定及进化特征分析 [J]. 南方农业学报, 2020, 51(4): 748-757.

[7] 张雪梅, 何兴金. 青藏高原特有植物青海当归的谱系地理学初探 [J]. 植物分类与资源学报, 2013, 35(4): 505-512.

[8] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志（第六卷第一分册, 蕨类植物门）[M]. 北京: 科学出版社, 1999: 178.

[9] 王特, 李兆福, 李涛, 等. 昆明山海棠治疗类风湿关节炎作用机制的研究进展 [J]. 风湿病与关节炎, 2019, 8(8): 60-63.

[10] 徐娥, 任慧珠. 小剂量雷公藤多甙对早期糖尿病肾病患者的临床疗效观察 [J]. 实用糖尿病杂志, 2020, 16(3): 57-58.

[11] Chen S L, Yao H, Han J P,. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species [J]., 2010, 5(1): e8613.

[12] Hamrick J L, Godt M J W.[M]. Massachusetts: Sinauer Associates Inc, 1990.

[13] Qiu Y X, Fu C X, Comes H P. Plant molecular phylogeography in China and adjacent regions: Tracing the genetic imprints of Quaternary climate and environmental change in the world’s most diverse temperate flora [J]., 2011, 59(1): 225-244.

[14] Hewitt G M. Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary [J]., 2004, 359(1442): 183-195.

[15] Zhao C, Wang C B, Ma X G,. Phylogeographic analysis of a temperate-deciduous forest restricted plant (Turcz.) reveals two refuge areas in China with subsequent refugial isolation promoting speciation [J]., 2013, 68(3): 628-643.

[16] 沈浪, 陈小勇, 李媛媛. 生物冰期避难所与冰期后的重新扩散 [J]. 生态学报, 2002, 22(11): 1983-1990.

[17] 陈冬梅, 康宏樟, 刘春江. 中国大陆第四纪冰期潜在植物避难所研究进展 [J]. 植物研究, 2011, 31(5): 623-632.

[18] 赵芳, 张百平, 朱连奇, 等. 秦巴山地垂直带谱结构的空间分异与暖温带—亚热带界线问题 [J]. 地理学报, 2019, 74(5): 889-901.

[19] 周先容, 尚进, 陈发波, 等. 巴山榧树及近缘种的psbA-trnH序列分析 [J]. 西部林业科学, 2015, 44(1): 16-21.

[20] 周先容, 汪建华, 尚进, 等. 金佛山喀斯特山地巴山榧树灌丛群落优势灌木种群的种间关系 [J]. 西南大学学报: 自然科学版, 2016, 38(9): 88-94.

[21] 周秉根, 卢晓. 扬子鳄如何渡过第四纪冰期 [J]. 华中师范大学学报: 自然科学版, 1994, 2: 260-262.

[22] 周秉根, 李刚, 姚敏, 等. 九华山第四纪冰缘地貌与古环境分析 [J]. 安徽师大学报: 自然科学版, 1994, 17(2): 48-53.

Phylogeography ofinferred based on ITS2 DNA sequence variation

LI Na1, 2, WANG Dan1, 2, CHEN Yi-long1, 2, YAO Yuan-yuan3, ZHANG Xiao-mei1, 2, LI Sheng-rong1, 2

1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China 2. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing 400065, China 3. College of Biological, Chemical Science and Engineering, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China

To studythe genetic characteristics and geographical distribution of three species of the genusby ITS2 DNA barcoding technique.A total of 223 samples from 28 populations ofwere collected. The genomic DNA extraction and ITS2 gene amplification and sequencing were performed on the above samples. Genetic diversity was analyzed by calculating haplotype diversity and nucleotide diversity. The dynamic change of social history was detected by drawing the curve of mismatch distribution. Based on the above data analysis, the differences among species, populations and populations, and the coefficient of genetic differentiation between species and populations were estimated.A total of 12 base mutation sites were detected in 223 samples from 28 populations of, which constituted 10 haplotypes. There were seven haplotypes in, and H2—H7 were unique haplotypes. There were four haplotypes in, and H8 was a unique haplotype. There were three haplotypes in. Among the three species, H1 is the haplotype of three species, H9 and H10 are the haplotypes ofand. The analysis of population genetic diversity showed thathad high haplotype and nucleotide polymorphism [d= 0.615 ± 0.024,i= (9.47 ± 0.58 )× 10−3] . The analysis of population genetic structure showed that the variation ofmainly existed among species (76.14%), and the variation of intraspecies and intrapopulation was 11.42% and 12.44%, respectively. The population dynamic analysis showed that,andhad experienced expansion, buthad not.The genetic diversity level of,andare higher than that of.used parts of Southwest China, Central China, and East China as refuges during the Quaternary ice age. After the ice age,spread around the refuge, forming the current distribution pattern.

;(Lévl.) Hutch.;Hook;Sprague et Takeda; ITS2 sequence; phylogeography; genetic characteristics

R282.12

A

0253 - 2670(2022)17 - 5476 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.024

2022-02-06

国家重大新药创制科技专项（2017ZX09101002）；重庆市基础科学与前沿技术研究项目（cstc2017jcyjAX0001，cstc2018jcyjAX0142）；重庆市社会事业与民生保障科技创新专项（cstc2017shms-zdyfX00012）

励 娜，主任中药师，从事中药资源、质量控制、中药制剂、中药炮制工艺及机制研究。E-mail: lina1281@163.com

张小梅，主任中药师，从事中药资源与物质基础研究、中药品种品种评价、中药新药研究。E-mail: 605050963@qq.com

李胜容，主任药师，从事中药资源与质量评价、中药新药研究开发。E-mail: 1079639273@qq.com

[责任编辑 时圣明]