基于1H-NMR结合LC-MS技术分析熊胆粉及常见胆类中药中的胆酸类成分

曹 妍，张佩杰，李 婷，许 霞，常安琪，李 军, 2，刘地发，屠鹏飞，宋月林, 2*

基于1H-NMR结合LC-MS技术分析熊胆粉及常见胆类中药中的胆酸类成分

曹 妍1，张佩杰1，李 婷1，许 霞1，常安琪1，李 军1, 2，刘地发3，屠鹏飞1，宋月林1, 2*

1. 北京中医药大学中药学院 中药现代研究中心，北京 100029 2. 北京中医药大学 中药品质评价北京市重点实验室，北京 100029 3. 江西青峰药业有限公司 创新天然药物与中药注射剂国家重点实验室，江西 赣州 341000

建立基于核磁共振氢谱技术（1H-NMR）结合液质联用技术（LC-MS）的分析方法，阐明熊胆粉中胆酸类成分组成，找出熊胆粉与其他常见胆类中药中的差异性成分。利用1H-NMR非靶标分析熊胆粉及其他常见胆类中药的化学成分组，通过信号归属表征熊胆粉中胆酸类成分组成，以1H-NMR图谱分段积分后峰面积为变量进行多元统计分析。利用LC-MS对熊胆粉及其他常见胆类中药中10个胆酸类成分（胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸）进行含量测定，并以含量为变量进行多元统计分析。基于1H-NMR图谱及多元统计分析发现胆酸类成分为胆类中药的主要成分，也是熊胆粉与其他常见胆类中药的主要差异性成分。结合文献及对照品比对，从熊胆粉中初步鉴定出7个胆酸类成分。进一步结合LC-MS含量测定结果和多元统计分析验证熊胆粉与其他常见胆类中药的主要差异性胆酸类成分为熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸。熊胆粉与其他常见胆类中药的胆酸类成分存在显著差异。与其他胆类中药相比，熊胆粉中熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸及其牛磺型结合胆酸含量较高。1H-NMR技术具有对化学成分组全面、快速分析的优势，可与LC-MS检测相互补充，共同应用于中药复杂体系成分分析和代谢组学的深入研究。

1H-NMR；LC-MS；熊胆粉；常见胆类中药；胆酸类成分；多元统计分析；熊去氧胆酸；鹅去氧胆酸；牛磺熊去氧胆酸；牛磺鹅去氧胆酸

胆类中药是我国传统中药的重要组成部分，如熊胆、蛇胆、猪胆、牛胆、羊胆、牛黄等，具有悠久的临床使用历史。其中熊胆粉是熊科动物黑熊Cuvier或棕熊L.经胆囊手术引流胆汁并干燥而得到的粉末。其性寒味苦，具有封脉窍、止腐、生肌、明目之功效，主治热病燥渴、风热目赤、黄疸等症[1]。现代临床研究表明熊胆中所含的牛磺熊去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸等几十种胆汁酸成分及胆固醇、氨基酸等对治疗肝胆疾病及因肝胆失调引起的相关疾病具有显著疗效[2-4]。目前以熊胆粉为原料的中成药已上市150多种，如熊胆胶囊、熊胆救心丸、熊胆痔灵膏等[5]。随着熊胆粉药用需求的增大和野生动物捕猎的禁止，市场上熊胆资源紧缺，经常有不法分子将猪、牛、羊胆通过黄柏或者黄连浸汁等方式进行混伪后销售[6]。因此，亟需建立快速、高效的胆类中药分析方法从而阐明熊胆粉化学成分组，进一步找出熊胆粉与其他常见胆类中药的差异性成分，推进熊胆粉替代资源开发工作，保证临床用药安全与有效。

核磁共振（NMR）及液质联用技术（LC-MS）作为最常用的代谢组学分析技术，经常用于中药复杂体系的分析[7-9]。其中核磁共振氢谱技术（1H-NMR）无需复杂的样品前处理，如分离和衍生化，无需预知目标化合物的结构类型，无需绘制标准曲线，即可在短时间内获得样品中化学成分组的定性、定量信息，非常适合非靶标整体代谢轮廓分析。并且实验后样品可再次回收使用，尤其适用于分析熊胆这类来源稀缺、价格昂贵的样品。NMR的主要缺陷是不具备色谱分离功能，并且灵敏度低。而LC-MS可以同时弥补这2个缺陷，对样品中的目标化合物进行更加准确地定性定量分析。目前，1H-NMR及LC-MS相结合的技术已经应用于代谢组学研究中，并且为化学成分组的分析提供了更多的信息[10-12]。前期课题组将二者结合的技术初步应用于蛇胆中化学成分分析，不仅可以通过1H-NMR快速了解蛇胆整体代谢轮廓谱，还进一步结合LC-MS提供的高分辨数据鉴定出57个胆酸类成分，基本阐明了蛇胆中胆酸类成分组成[12]。因此，本实验将通过利用1H-NMR对熊胆粉及常见胆类中药中化学成分组进行非靶标性轮廓分析，阐明熊胆粉中的主要胆酸类成分，结合多元统计分析找出熊胆粉及其他常见胆类中药的差异性成分。然后利用LC-MS对主要胆酸类成分进行绝对定量分析，找出更加精准的差异性成分，为建立熊胆粉及常见胆类中药的质量标准提供依据。同时探讨1H-NMR与LC-MS联合应用于胆类中药质量快速评价的可能性和科学价值，为中药化学成分的分析提供新思路。

1 材料

1.1 仪器

Varian Unity-500型核磁共振波谱仪，配备TCI冷冻探头及Z方向脉冲梯度场，美国Varian公司；Mettler ME204型电子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；超声波辅助仪，美国Danbury公司；HPLC液相色谱仪，配备LC-20ADXR泵、SIL-20AC自动进样器、CTO-20A柱温箱、DGU-20A脱气机、CBM-20A控制器，日本岛津公司，连接5500Qtrap三重四级杆串联线性离子阱质谱仪，美国ABSciex公司；Milli-Q超纯水净化系统，美国Millipore公司。

1.2 试剂

分析级甲醇（批号20189526）、磷酸二氢钾（批号20183642）、磷酸氢二钠（批号20183642）均购自北京化工厂；LC-MS级甲醇（批号186273）、甲酸（批号186204）均购自美国Thermo-Fisher公司，水为实验室自制Milli-Q超纯水。氘代甲醇（批号189773）及重水（批号189826）购自美国CIL公司；sodium 3-trimethlysilyl[2,2,3,3-4] propionate（TSP-4，批号T175296）购自美国阿法埃莎（Alfa Aesar）化学有限公司；胆汁酸对照品包括去氧胆酸（DCA，批号B21032）、熊去氧胆酸（UDCA，批号B21405）、猪去氧胆酸（HDCA，批号B21152）、鹅去氧胆酸（CDCA，批号B20347）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA，批号B21642）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA，批号B20624）、甘氨熊去氧胆酸（GUDCA，批号B21091）、胆酸（CA，批号B20274）、牛磺胆酸（TCA，批号B21318）、甘氨胆酸（GCA，批号B22379）、甘氨猪去氧胆酸（GHDCA，批号B21825）、人参皂苷Rb2（ginsenoside Rb2，批号111715）均购自上海源叶生物科技有限公司。经HPLC-ELSD检测，各对照品质量分数均大于98%。

1.3 样品

熊胆粉（XD1～7，批号分别为20181101、20180103、20181201、20180101、20180701、20180401、20180801）均购自黑龙江黑宝药业股份有限公司，XD8（批号2-131）购自吉林省延边州第一养殖场义城有限公司，XD9（Z01097289）购自吉林白头山制药有限公司；熊胆（XD10，批号Z20183143）购自中国药材公司；蛇胆（SD）、鸡胆（JD）、鸭胆（YAD）、鹅胆（ED）、牛胆（ND）、牦牛胆（MND）、羊胆（YD）、猪胆（ZD）、牛蛙胆（NWD）、狗胆（GD）、兔胆（TD）、鲤鱼胆（LYD）、白鲢鱼胆（BLYD）、武昌鱼胆（WCYD）、草鱼胆（CYD）从当地屠宰场购得，人工牛黄（RGNH，批号20183253）和天然牛黄（TRNH，批号20188223）均购自北京同仁堂药店。所有样品均经过北京大学屠鹏飞教授鉴定为正品，标本存放于北京中医药大学中药学院中药现代研究中心。

2 方法与结果

2.1 利用1H-NMR非靶标性分析熊胆粉及其他常见胆类中药

2.1.1 氘代磷酸缓冲液（PBS）的制备 精密称取氯化钠200.00 mg、磷酸二氢钾89.50 mg、氯化钾5.00 mg、磷酸氢二钾6.75 mg于烧杯中，用重水充分溶解。另外精密称取一定量的TSP-4固体粉末，配制成含0.03% TSP-4的10 mmol/L磷酸盐重水缓冲溶液，与氘代甲醇等体积混合，即得混合氘代溶剂，待用。

2.1.2 核磁共振测试供试样品和对照样品的制备 所有胆类中药样品均在40 ℃烘箱中干燥处理3 d，粉碎后过40目筛，精密称取粉末20 mg，加入50倍量甲醇，超声提取30 min，加入甲醇补足失重，取混悬液置于干净离心管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液至另一个干净离心管中，减压浓缩后置于真空干燥箱，30 ℃环境中干燥处理2 h，用0.5 mL混合氘代溶剂复溶残渣，并迅速转移至5 mm核磁管中，即得供试样品。取“1.2”项下对照品各2.0 mg，用0.5 mL混合氘代溶剂溶解，并迅速转移至5 mm核磁管中，即得对照品。

另精密称取各批次熊胆粉各20 mg，混合均匀后，称取120 mg，一式6份平行制备，作为质控样品，采集1H-NMR图谱，通过图谱叠加判断整个分析系统的重现性。

2.1.3 样品1H-NMR测定条件 各样品的1H-NMR测定条件为样品在298 K于500 MHz核磁共振仪上测定，测定频率为499.91 MHz，信号累积256次，弛豫时间（d1）2 s，谱宽8 012.6 Hz （−1.0～16.0），采集时间为2.044 7 s，脉冲角度90°（11.05 μs），LB为0.3 Hz。峰的对称性、基线与定标峰校正均为人工手动进行，利用TSP-4定标，CD3OD进行锁场。

2.1.41H-NMR数据处理 各批次样品的1H-NMR数据转成ASCII格式，进一步用MestReNova软件（Version 11.0.4，西班牙Mestrelab Research公司）处理数据。对核磁数据进行分段积分、归一化和尺度标准化等处理，使数据结构标准化。以0.02积分段对0.5～10.0进行分段积分，并将数据转换为.csv格式，导入SIMCA-P软件（Version 14.0，瑞典Umetrics公司）进行多元统计学分析。

2.1.5 基于1H-NMR图谱分析熊胆粉及常见胆类中药中的胆酸类成分 中药1H-NMR图谱是其各组分质子信号的叠加，图谱的信号往往来源于主要成分。熊胆粉的典型1H-NMR图谱如图1所示。将图谱分为2个区域，芳香区（5.0～9.0）及脂肪区（0.5～4.5），可以直观发现信号峰集中在脂肪区，其中亚甲基和次甲基的出峰位置处（1.2～2.4）信号重叠较为严重，表明熊胆中主要成分为胆酸类成分。通过与对照品（如UDCA、CDCA、TUDCA、TCDCA、DCA等）比对，并结合文献的报道及开源数据库，如HMDB（www.hmdb.ca）、BMRB（http://www.bmrb. wisc.edu/ref_info/）等，对各主要信号进行结构归属。在高场区，可以明显地观察到C-18、C-19、C-21角甲基在0.67～0.69和0.85～1.00处出现裂分的信号峰。对照品UDCA在0.68 (3H, s, 18-CH3)、0.94 (3H, s, 19-CH3) 和0.96 (3H, d,= 6.5 Hz, 21-CH3) 出峰，CDCA的角甲基信号出现在0.67 (3H, s, 18-CH3)、0.92 (3H, s, 19-CH3) 和0.95 (3H, d,= 4.5 Hz, 21-CH3)，而CA的角甲基信号出现在0.73 (3H, s, 18-CH3)、0.92 (3H, s, 19-CH3) 和1.02 (3H, d,= 6.5 Hz, 21-CH3)。这些信号在熊胆的1H-NMR图谱中均可以找到对应的信号峰。图1中也可以明显看到牛磺酸结合型胆酸的牛磺酸残基特征性信号3.57 (2H, t,= 6.5 Hz, H-25) 和3.08 (2H, t,= 6.5 Hz, H-26)，由此推测熊胆中可能含有UDCA、CDCA、CA及其牛磺酸结合型胆酸，与文献报道一致[13]。结合文献报道[14]，熊胆中还含有牛磺熊去氧酮胆酸，在该图谱中也可以归属其信号（表1）。

数字编号与表1相同

表1 熊胆粉1H-NMR谱化学位移归属(氘代甲醇-重水1∶1)

Table 1 Signal assignment for 1H-NMR spectrum of bear bile powder (CD3OD-D2O 1∶1)

编号化合物化学位移(δ)文献 1UDCA*0.68 (3H, s), 0.94 (3H, s), 0.96 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.36 (1H, s)15-16 2CDCA*0.67 (3H, s), 0.92 (3H, s), 0.95 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.77 (1H, m), 4.01 (1H, m)15-18 3CA*0.73 (3H, s), 0.92 (3H, s), 1.02 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.37 (1H, m), 3.79 (1H, m), 3.97 (1H, m)15-18 4TUDCA*0.65 (3H, s), 0.91 (3H, s), 0.92 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.41 (1H, m), 3.43 (1H, m), 3.46 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.97 (2H, t, J = 6.5 Hz)18 5TCDCA*0.69 (3H, s), 0.90 (3H, s), 0.95 (3H, d, J = 6.5 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.5 Hz), 3.55 (2H, t, J = 6.5 Hz), 3.35(1H, m), 3.88 (1H, m)18 6TCA*0.58 (3H, s), 0.80 (3H, s), 0.84 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.28(2H, t, J = 6.5 Hz), 3.60 (2H, t, J = 6.5 Hz)18 7牛磺熊去氧酮胆酸0.67 (3H, s), 0.97 (3H, s), 0.92 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.79 (1H, m), 3.53 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.92 (2H, t, J = 6.5 Hz,)19

*对照品指认

*identities were confirmed with authentic compounds.

熊胆、鸡胆、鹅胆等10余种常见胆类中药提取后，平行采集1H-NMR图谱（图2），可以明显看出不同胆类中药的1H-NMR图谱存在一定差异。在人工牛黄、羊胆、牛胆、牦牛胆、熊胆、狗胆、兔胆、蛇胆、鹅胆、鸡胆、鸭胆的图谱中都出现了牛磺酸残基的特征性信号3.57 (2H, t,= 6.5 Hz, H-25) 和3.08 (2H, t,= 6.5 Hz, H-26)，表明这些胆类中药均含有丰富的牛磺型胆酸。在猪胆、牛胆、牦牛胆的1H-NMR图谱中可以观察到甘氨型胆酸的甘氨酸残基特征性信号3.74 (2H, t,= 6.5 Hz, H-25)，表明它们富含甘氨型结合胆酸。收集到的4种鱼胆的1H-NMR图谱轮廓与其他胆类中药明显不同，既没有牛磺酸残基的特征信号也没有甘氨酸残基的特征信号，其主要成分为游离型胆酸。因此，通过从1H-NMR图谱可以快速了解胆类中药中主要胆酸类成分的结构类型。天然牛黄的1H-NMR图谱相对简单，与对照品比对后发现天然牛黄中主要含有CA和TCA。由于天然牛黄来源稀缺，供不应求，人工牛黄就是人们在研究牛黄的化学成分基础上，采用成分配制的方式制作的替代品。根据《中国药典》2020年版[20]对人工牛黄的记载，“本品由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工而成”，其中猪去氧胆酸是由猪胆汁提取加工制成，胆固醇是由牛、猪、羊脑经提取加工制成，所以人工牛黄与猪胆、牛胆和羊胆1H-NMR图谱都有相似之处，在人工牛黄中也可以看到猪胆的特征性成分HDCA的特征信号0.83 (3H, s, 18-CH3)[21-22]。牦牛胆和牛胆的1H-NMR图谱相似度较高，主要成分均为牛磺型胆酸，尤其是TCDCA含量较高[23]。蛇胆和兔胆的1H-NMR图谱中信号相对较少，与对照品比对后发现蛇胆的1H-NMR图谱与TCA对照品的图谱几乎一致，而兔胆与DCA对照品图谱非常相似，表明TCA和DCA分别是蛇胆和兔胆的主要成分，与文献中利用LC-MS技术测得结果一致[12,24-25]。

图2 熊胆粉及其他常见胆类中药的1H-NMR图谱

2.1.6 胆类中药1H-NMR测定结果的主成分分析（principal component analysis，PCA） 为了更全面地比较熊胆粉与其他常见胆类中药中化学成分组的差异，将所有批次样品的数据转成ASCII格式，并利用MestReNova软件分段积分后，获得定量数据矩阵。将10批熊胆粉归为一组，17批其他胆类中药样品归为一组，进一步采用多元统计分析软件SIMCA-P进行无监督性的PCA。各批次样品经过PCA后的得分图（score plot）和载荷图（loading scatter plot）分别如图3-A和图3-B所示。

所有的样品都分布在95%的置信区域内，2组具有明显的分离趋势，表明熊胆粉与其他胆类中药的化学成分组存在一定差异。如得分图（图3-A）所示，4种鱼胆样品分布在右侧，而非鱼胆类样品都分布在左侧，进一步证实鱼胆样品与其他胆类中药化学成分组存在差异。另外，载荷图（图3-B）显示分布在第1、4象限的差异性信号大部分化学位移隶属于脂肪区，例如脂肪酸的特征信号1.30、1.32、1.38，表明鱼胆中脂肪酸含量较高。除XD8（购自吉林义城）外，大多数熊胆粉样品分布在第3象限，并且XD9与XD1～XD7及XD10相距较远，结合载荷图分析发现不同产地和厂家的熊胆粉在胆酸类成分含量上也存在差异。在第3象限可以看到UDCA特征信号0.68、0.94、0.96，CDCA的特征信号0.92和牛磺酸残基特征信号2.97、3.46等，表明与其他胆类中药相比，熊胆粉中UDCA、CDCA及其牛磺型结合胆酸含量较高。

图3 熊胆粉与其他常见胆类中药的PCA得分图(A) 和载荷图(B)

2.2 利用LC-MS靶标性分析熊胆粉及常见胆类中药的胆酸类成分

2.2.1 LC-MS测试对照样品和供试品溶液的制备1H-NMR测定结束后，将“2.1.2”项下配制的核磁供试样品和对照样品进行回收。然后取各对照品适量，精密称定，分别用DMSO配制成10 mmol/L的对照品储备液，4 ℃保存，待用。取内标物人参皂苷Rb2（IS）适量，用DMSO配制成10 mmol/L的内标储备液，再用50%甲醇稀释20倍，配制成500 µmol/L的内标溶液，即得对照样品。精密称取回收后的各批次胆类中药粉末10 mg，分别用1 mL的70%甲醇水溶液复溶，涡旋后经12 000 r/min 离心10 min，取97 µL上清液，加入3 µL内标溶液，涡旋1 min，即得LC-MS供试品溶液。

2.2.2 LC-MS测定条件 液相条件、质谱基本参数设置同文献所述[12]。所测胆酸类成分的定量离子对、保留时间及其他质谱参数（脱簇电压和碰撞能）见表2。

2.2.3 LC-MS测定方法学考察 吸取适量各对照品的储备液，混合，并用50%甲醇水稀释至1.0 mL，配制成CA、HDCA、TUDCA、TCA、GHDCA、GUDCA、CDCA、TCDCA、UDCA、GCA质量浓度分别为1450、1400、1780、1840、1600、714、1400、1780、836、714 µg/mL的混合对照品储备液。经50%甲醇水梯度稀释后，加入等量的内标溶液，按照“2.2.2”项条件进行测定。以各胆酸类成分峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标（），各胆酸类成分质量浓度作为横坐标（），绘制标准曲线，计算线性回归方程及相关系数（）。同时对检测限（LOD）、定量下限（LLOQ）、回收率、精密度、重复性和稳定性进行考察[26]。10个待测成分的线性回归方程、线性范围、、LOD和LLOQ见表3。考察回收率、精密度、重复性和稳定性，各对照品成分质量分数的RSD均小于15%，均符合方法学的要求。

表2 10种胆酸类成分及内标物的保留时间、离子对、脱簇电压和碰撞能

Table 2 Retention time, ion transition, declustering potential, and collision energy of each bile acid and internal standard (IS)

化合物tR/min离子对驻留时间/ms脱簇电压/V碰撞能/eV TUDCA8.18498.3＞80.050−100−130 TCA8.65514.3＞80.050−100−130 GUDCA12.58448.3＞74.050−100−80 GCA12.73464.3＞74.050−100−80 GHDCA12.95448.3＞74.050−100−80 TCDCA13.29498.3＞80.050−100−130 人参皂苷Rb2（IS）13.311 123.3＞1 077.350−100−30 CA19.92407.3＞407.350−100−60 UDCA21.55391.3＞391.350−100−15 HDCA22.43391.3＞391.350−100−15 CDCA24.77391.3＞391.350−100−15

2.2.4 熊胆粉及常见胆类中药中主要胆酸类成分含量测定及PCA 将制备好的各胆类中药的LC-MS测试供试品溶液注入LC-QqQ系统，按照“2.2.2”项条件进行样品测定，重复3次。将所得峰面积代入标准曲线，计算各供试品溶液中胆酸类成分的含量。如表4所示，不同胆类中药中胆酸类成分含量存在差异，收集的10批熊胆粉中胆酸类成分含量也存在一定个体差异。各胆类中药中含量较高的胆酸类成分与前期1H-NMR测试分析结果一致。熊胆粉中TUDCA和TCDCA的含量最高，二者的含量占比高达90%以上。其中TUDCA含量在296～990 nmol/mg，远高于其他胆类中药，TCDCA含量在198～383 nmol/mg。熊胆粉中甘氨型胆酸含量较少，GCA、GUDCA及GCDCA含量均低于50 nmol/mg。另外，只有熊胆粉中UDCA含量在定量限以上，含量为7.59～31.18 nmol/mg，是熊胆粉的特征性成分，与文献报道一致[27-29]。HDCA及其结合型胆酸是猪胆的特征性成分，在猪胆中含量较高。由于人工牛黄的配方中加入了HDCA，因此在人工牛黄中也存在大量HDCA，然而在天然牛黄中并没有检测到该成分。同时，牛胆中的TCA和GCA含量远高于天然牛黄，表明胆汁和结石中的胆酸类成分可能存在一定差异。所测定的10个胆酸类成分在鱼类胆汁中含量较少，仅有少量CA、TCA和TCDCA存在。

表3 10个胆酸类成分的线性方程、相关系数、线性范围、定量下限和检测限

Table 3 Linear regression data, correlation index, lower limits of quantification (LLOQ) and limits of determination (LOD) for 10 bile acids

分析物线性方程r线性范围/(ng·mL–1)LOD/(ng·mL–1)LLOQ/(ng·mL–1) TCAy＝0.065 2 x＋1.060.999 81.47～18400.150.525 GCAy＝0.007 09 x＋0.006 560.999 80.57～7140.050.263 CAy＝0.373 x＋7.860.998 21.16～14500.020.100 GUDCAy＝0.177 x＋0.061 60.999 60.57～7140.050.253 GHDCAy＝0.079 2 x＋0.052 60.999 61.28～16000.050.640 TUDCAy＝0.183 x＋4.170.999 61.42～17800.150.535 TCDCAy＝0.002 11 x＋2.070.996 81.42～17800.150.523 UDCAy＝0.003 68 x＋2.410.998 01.34～8360.050.167 HDCAy＝0.113 x＋17.70.999 01.12～14000.050.153 CDCAy＝0.107 x＋37.50.998 31.12～14000.050.175

表4 熊胆粉及其他常见胆类中10个胆酸类成分含量测定结果(n = 3)

Table 4 Determination results of 10 bile acids in bear bile powder and other medicinal bile(n = 3)

样品含量/(nmol·mg−1) GHDCAGUDCACATCAGCATUDCATCDCAUDCAHDCACDCA MND0.35ND12.99248.72445.4084.84388.78BLBL1.45 ND1.380.6319.36413.77510.23BL411.82BLBL1.79 RGNHBLND22.9236.07119.58BL76.35ND104.223.86 ZD518.01ND1.322.7838.59BL11.72BL4.53BL TRNHBLBL18.3845.72134.59BL2.48BLBLBL YDBLBL8.2652.1223.8161.01220.44NDND2.02 SDNDND0.561 892.801.01BL104.21NDBLBL JDNDND1.4389.150.69BL889.80NDBL7.99 YADNDNDBL103.430.4282.83118.24NDBL8.82 EDNDND1.1951.66BLBL193.39NDBL11.90 GDBLND1.54404.163.4059.24365.73NDBL1.08 TDBLND0.1653.4918.3556.7372.59NDBL1.99 NWDBLND0.631.67BL23.440.07NDBLBL CYDBLND9.536.03BLBL0.05NDBL0.62 WCYDBLNDBL7.91BLBL0.04NDBLBL LYDBLND3.5429.12BLBL0.34NDBLBL BLYDBLND1.893.72BLBL0.02NDBLBL XD1BLNDBL9.37BL792.17198.407.59ND27.49 XD2BLND4.9918.93BL990.97231.4628.67ND41.05 XD3BLBL2.4327.48BL347.39292.5921.36ND35.87 XD4BLBL1.9614.22BL547.19371.747.26ND13.05 XD5BLBL6.4831.14BL492.97383.7730.66ND39.58 XD6BL0.101.2121.79BL600.65310.3921.04ND23.13 XD7BLBL1.1521.78BL411.96209.339.39ND19.23 XD8BLBL5.1218.69BL296.46302.0319.03ND28.02 XD9BL0.5721.8161.2730.51687.75242.0423.10ND43.99 XD10BLND2.0320.16BL517.54284.3931.18ND19.33

ND-未检出 BL-低于检测限

ND-not detedcted BL-below limit of detection.

为了进一步比较熊胆粉与其他常见胆类中药中所测定的10个胆酸类成分含量差异，将含量测定结果导入SIMCA-P软件进行PCA。得分图（图4-A）显示，除了SD，所有样品均分布95%置信区间内。并且以10个胆酸类成分含量为变量，2组具有明显的分离趋势，表明所测定的10个胆酸类成分在熊胆粉与其他常见胆类中药中含量具有显著差异。熊胆粉样品全部分布在得分图的第2象限，而载荷图（图4-B）中第2象限距离原点较远的分别是TUDCA、TCDCA、UDCA和CDCA，即表示引起熊胆与其他常见胆类差异的胆酸类成分主要是TUDCA、TCDCA、UDCA和CDCA，与“2.1.6”项结果一致。因此，将这4个成分含量作为熊胆粉质量控制的重点指标性成分较为合理。另外，结合载荷图分析发现蛇胆分布在95%的置信区域外是由于TCA含量非常高，鸡胆样品距离熊胆粉组比较近是由于TCDCA含量较高。

图4 熊胆粉与其他常见胆类中药中10个胆酸类成分含量的PCA得分图(A) 和载荷图(B)

3 讨论

3.1 提取条件的考察

实验前期通过对使用20%、50%、70%甲醇水和甲醇提取的熊胆粉提取物进行比较，发现在甲醇熊胆粉提取物中检测到的化合物数量最多、峰形和分离度最好。并且由于胆酸类成分遇水振摇后会产生大量泡沫，在中药提取液浓缩时容易喷出而难以控制平行操作，所以本实验采用纯甲醇作为提取溶剂。另外，课题组前期[10]发现将样品溶于缓冲盐溶液可以有效缓解利用1H-NMR批量检测时产生的化学位移漂移问题。本实验中6批质控样品的1H-NMR图谱可以完全重叠，其化学位移值和峰强度均一致，表明检测系统重现性良好。

3.2 1H-NMR非靶标检测及LC-MS靶标检测在胆类中药化学成分分析中的应用

1H-NMR最大的优势在于可以对样品中所有化学成分进行无结构、无极性偏向性地检测。因此，利用1H-NMR分析熊胆粉及常见胆类中药可以同时实现氨基酸、脂肪酸及胆汁酸等成分的检出，通过分段积分即可获得所有成分的相对定量数据，从而可以对整体代谢轮廓进行初步分析和比较。然而在使用LC-MS检测时，胆酸类成分通常在C18柱保留效果更好，负离子模式下响应较好；而像氨基酸这种大极性成分在C18柱上几乎不保留，通常使用Amide柱实现色谱分离后于正离子模式下检测，所以需要构建联柱系统并且在正、负离子切换模式下才可以实现样品中的胆汁酸、氨基酸等成分的同时检测[8-9]。但是1H-NMR不具备分离功能，胆酸类成分结构十分相似导致信号堆叠严重，给差异性成分的鉴定和微量胆酸类成分的检出带来很多困难。因此，在对中药复杂体系整体轮廓初步分析比较时，1H-NMR具有一定优势；需要对化学成分进行准确定性定量分析时，LC-MS选择性更高。先利用1H-NMR非靶标性分析，将样品回收后进一步利用LC-MS靶标性分析，既可以实现优势互补，也符合了“绿色化学”的理念。因此，1H-NMR与LC-MS等检测平台信息的相互补充可以为中药复杂体系分析提供更加全面、准确的定性定量信息，为分析胆类中药和建立质量标准提供更可靠的参考依据。

3.3 小结

本研究基于1H-NMR结合LC-MS技术比较研究熊胆粉及常见胆类中药的胆酸类成分，基于1H-NMR图谱从熊胆粉中初步鉴定出7个胆酸类成分，利用LC-MS对10个胆酸类成分进行准确定量，初步阐明熊胆粉中胆酸类成分组成。基于熊胆粉与其他常见胆类中药的1H-NMR图谱分段积分数据和10个胆酸类成分的准确定量结果，结合多元统计分析发现熊胆与其他常见胆类中药的胆酸类成分存在显著差异，差异性成分主要是UDCA、CDCA、TUDCA和TCDCA，为建立熊胆粉质量标准和分析常见胆类中药奠定基础。今后，本课题组将收集更多的胆类中药样品，对常见胆类中药的胆酸类成分组成进行全面分析。

基于本研究结果，验证了1H-NMR在化学成分轮廓分析中应用的可行性，有望实现中药等复杂体系不依赖于对照品的定性定量分析。同时，为珍贵的中药样本以及临床样本分析提供了思路，先利用1H-NMR非靶标性分析，再结合LC-MS对目标性成分准确分析，可以基于有限的样品量提供更加全面、准确的定性和定量信息，推动中药复杂体系及临床代谢组学的发展。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Analysis of bile acid profiles in bear bile powder and other medicinal bile using1H-NMR and LC-MS

CAO Yan1, ZHANG Pei-jie1, LI Ting1, XU Xia1, CHANG An-qi1, LI Jun1, 2, LIU Di-fa3, TU Peng-fei1, SONG Yue-lin1, 2

1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Chinese Meteria Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. State Key Laboratory of Innovative Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine Injections, Jiangxi Qingfeng Pharmaceutical Co., Ltd., Ganzhou 341000, China

To establish an analysis method based on1H-NMR combined with LC-MS technology to clarify the bile acid profiles in bear bile powder, and find out the differences between bear bile powder and other medicinal bile.The1H-NMR spectra of each medicinal bile was recorded in parallel, the bile acid profiles of bear bile powder were characterized by signal attribution, and the datasets of piecewise integration were introduced for multiple statistical analysis to find the potential biomarkers. Then, the content of 10 bile acids [cholic acid (CA), ursodeoxycholic acid (UDCA), hyodeoxycholic acid (HDCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), tauroursodeoxycholic acid (TUDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), glycyrsodeoxycholic acid (GUDCA), glycohyodeoxycholic acid (GHDCA), taurocholic acid (TCA), glycocholic acid (GCA)] were determined using LC-MS, and then the content was used as variables for multivariate statistical analysis.Based on1H-NMR spectrum and multivariate statistical analysis results, it was found that bile acid profiles were the main components of medicinal bile and the main differences between bear bile powder and other medicinal bile. With the assistance of literature and reference compounds, seven bile acids were tentatively identified from the representative spectrum of bear bile powder. Combined with LC-MS results, it was found that UDCA, CDCA, TUDCA and TCDCA contributed to primary differences.The bile acid profiles in bear bile powder is significantly different from that in other medicinal bile, UDCA, CDCA, TUDCA and TCDCA have the potential to be the biomarkers. Furthermore,1H-NMR spectroscopy can provide comprehensively qualitative and quantitative information for TCMs, and it should be an eligible tool as well as LC-MS for the quality evaluation of TCMs.

1H-NMR; LC-MS; bear bile powder; other medicinal bile; bile acid profiles, multivariate statistical analysis; hyodeoxycholic acid; chenodeoxycholic acid; tauroursodeoxycholic acid; taurochenodeoxycholic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2022)17 - 5283 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.004

2021-05-06

国家自然科学基金项目（81773832）；创新天然药物与中药注射剂国家重点实验室开放课题（QFSKL2018002）；中国科协青年人才托举工程（2017QNRC001）

曹 妍，博士研究生，研究方向为中药质量评价和药效物质基础。E-mail: cyan199409@163.com

宋月林，研究员，博士生导师，研究方向为中药质量评价和药效物质基础。E-mail: syltwc2005@163.com

[责任编辑 王文倩]