脱落酸处理对油菜幼苗镉积累和毒害作用的影响

余燕，张艺舜，李瑞，贺原，赵雪，汪华志，张付贵，朱宗河，周可金

（安徽农业大学农学院，安徽合肥，230036）

镉（cadmium，Cd）是生物毒性最强的重金属元素之一，具有致病、致癌和致突变的作用。随着工业、城市和农村的快速发展，我国农田土壤Cd 污染形势日益严峻。据统计，我国Cd污染土壤面积已达20 万公顷，约占耕地面积的20%[1,2]。《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国耕地Cd 污染点位超标率最高（7.0%），为首要污染物。除了具有一般重金属污染的共性外，Cd 还具有移动性强、毒性高和降解难等特点[3,4]。土壤Cd 污染不仅会引起土壤功能退化和作物生长受阻导致减产，还容易被农作物吸收，在食物链富集，危害动物和人体健康[3,5,6]。油菜（Brassica napusL.）是我国广泛种植的油料作物，是植物油脂和蛋白的重要来源。此外，油菜还具有蔬用、饲用、肥用、蜜用和花用等多种功能，其多功能开发利用近年来得到了大量的探索，并集成了一批高效的开发模式[7,8]。但是油菜具有较强的Cd 吸收积累能力，而油蔬两用的油菜常种植在城乡结合部中轻度污染农田土壤中，其生产面临着较大的Cd污染风险[9]。因此，亟需开展缓解油菜Cd 毒害及减少可食部位Cd积累的调控方法及其机理研究。

应用化学调控物质是缓解作物Cd 毒害以及植株Cd 积累的一种经济有效的栽培管理措施[10～13]。脱落酸（abscisic acid，ABA）是植物体内一种重要的激素物质，研究发现其不仅对植物的生长发育过程有调节作用，也参与了植物对逆境胁迫，包括Cd 胁迫的响应过程[12]。例如，在水稻叶片[14]、西红柿块茎[15]、柑橘[16]和香蒲[17]等植物中研究发现，Cd 处理能够增加植物内源ABA 的含量。在水稻中进一步的研究发现，Cd 调节的ABA 含量变化与稻秧的耐Cd性呈正相关关系[14]。外源应用ABA 可显著缓解Cd对拟南芥[10]、绿豆[18]、水稻[19]、小麦[20]等的毒害，促进植株的生长，提高生物量，降低植株新叶的萎黄程度。然而，ABA 处理对于Cd 胁迫下油菜耐Cd 性的影响及其调控机理尚不清楚。

因此，本研究以南方主栽的甘蓝型油菜沣油737 为材料，通过水培试验，探究外源ABA 处理对Cd 胁迫下油菜幼苗的干鲜重、根系形态等农艺性状，根系活力、丙二醛以及活性氧等损伤生理指标，以及抗氧化酶活性和Cd 含量等的影响，以期阐明ABA处理对油菜Cd毒害作用的影响及其作用机理，为实现增强作物耐Cd 性和可食部位安全性的生产调控措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

甘蓝型油菜品种沣油737，购买于陕西荣华农业科技有限公司。脱落酸（ABA，分析纯）购买于阿拉丁试剂公司。选取饱满均匀的油菜种子用1%的NaClO 消毒、浸种12 h 后移至铺有六层纱布的发芽盒中催芽12 h，待种子露白后播于盛有1/4 Hoagland营养液（pH 5.5）的方形塑料盆中。出苗后，选择大小一致的幼苗移植到盛有1/2 Hoagland 营养液（pH 5.5）的黑色塑料烧杯中继续培养一周，之后将营养液更换为完全Hoagland 营养液（pH 5.5）培养一周，然后选取长势一致的幼苗添加不同的试剂处理一周后取样待测。营养液每四天更换一次。完全营养 液 主 要 由1 mmol/L CaCl2，3 mmol/L KNO3，1 mmol/L NaH2PO4，0.5 mmol/L MgSO4，50 µmol/L Fe-EDTA， 0.5µmol/L ZnSO4， 0.1µmol/L（NH4）6Mo7O24，0.1 µmol/L CuSO4，0.5 µmol/L MnSO4和10 µmol/L H3BO3。人工气候箱的环境相对湿度75%，温度24℃/18℃（昼/夜），光周期为昼/夜16 h/8 h，光强度14 400 lx。

试验于气候箱中采用水培方式进行，采用完全随机区组设计，每个处理设置3组生物学重复，每组6棵幼苗。镉（Cd）处理浓度分别为：5、10、20、30、40µmol/L，采用CdCl2配置母液加入营养液中，随后用HCl 和NaOH 调 节pH 至5.5±0.1。ABA 浓 度 分 别为：5、10、15、20、30µmol/L，具体试验处理设置见表1。处理1 周后，取样进行农艺性状的测定，筛选出适宜的Cd 处理浓度和ABA 处理浓度。然后，设置对照（CK）、镉处理（20 µmol/L Cd）、ABA+Cd（15µmol/L ABA+20 µmol/L Cd）三 个 处 理 继 续 后 续试验。

表1 试验处理Table 1 Abbreviation and name of treatments

1.2 测定指标与方法

1.2.1 农艺性状 处理一周后，将油菜植株按照地上部、根系分开取样，洗净擦干后称取鲜重，随后放入烘箱中105℃杀青30 min，并在80℃条件下烘干至恒重，称取干重。同时，采用SPAD 型便携式叶绿素测定仪（SPAD-502 Plus）进行测定SPAD 值。根系生长及形态采用根系扫描仪进行扫描，并用Win-RHIZO根系分析系统进行分析。

1.2.2 损伤生理指标 处理一周后，取幼苗的根系，参照陈瑛等[21]采用TTC 法测定根系活力。根系膜脂过氧化程度参照Yu 等[22]采用硫代巴比妥酸反应法测定MDA含量。

1.2.3 活性氧含量 取处理一周后的油菜幼苗根系洗净测定过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2·-）含量，分别参照Yu等[22]通过硫酸钛反应法和羟胺氧化法进行。

1.2.4 抗氧化酶活性 根系抗氧化酶活性的测定参照Yu等[23]的方法进行。幼苗处理一周后，取根系洗净擦干称鲜重，液氮研磨后加入50 mmol/L pH 7.0 的PBS 提取液（内含1 mmol/L EDTA 和1%的PVP），于12 000g 4℃下离心20 min 后保留上清液用于SOD、CAT 和POD 的测定。其中，超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）的测定采用氮蓝四唑（nitro blue tetrazolium）光化还原法进行，以NBT 抑制50%光化还原为一个活性单位（U）计算SOD 酶活。过氧化氢酶（CAT，EC 1.11.1.6）活性通过测定反应液中H2O2的降解速率获得，ε=39.4 (mol/L)-1cm-1。过氧化物酶（POD，EC 1.11.1.7）活性通过愈创木酚法进行测定，ε=26.6(mol/L)-1cm-1。

1.2.5 镉含量 植株不同部位的Cd 含量参照Yu等[22]采用硝酸法硝化，通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定。同时计算Cd 转运系数，公式如下：Cd转运系数=Cd叶片/Cd根系。

1.3 数据分析

采用DPS 18.10 数据处理系统进行方差分析（ANOVA），处理间采用最小显著差异法（LSD 法）比较差异显著性（P＜0.05），采用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的Cd处理对油菜幼苗生长的影响

由表2 可见，Cd 处理会抑制油菜幼苗的生长，且抑制程度随Cd 处理浓度的增加而加重。除低浓度（5µmol/L）下油菜幼苗根系的鲜重、干重与CK 相比差异不显著外，油菜幼苗的地上部鲜重、干重以及根系活力均随Cd处理浓度的增加而显著下降（表2）。SPAD值则呈现随Cd浓度的增加先降低后增加的趋势，在20µmol/L Cd处理时下降最为厉害，仅为对照的55.04%，因此我们后续试验选择这一浓度进行处理。此时，油菜的地上部鲜重、根系鲜重、地上部干重、根系干重以及根系活力分别较对照下降了50.98%、38.88%、44.35%、20.64%、44.96% 和68.51%。

表2 不同浓度镉处理对油菜幼苗生长的影响Table 2 Effects of different concentrations of Cd treatments on growth of rapeseed seedlings

2.2 不同浓度ABA 处理对Cd 胁迫下油菜幼苗生长的影响

由表3可见，5～20µmol/L ABA 处理不同程度地缓解了Cd对油菜幼苗生长的抑制，且缓解作用随着浓度的增加呈现先增强后减弱的趋势，在高浓度（30 µmol/L）时出现了加剧毒害的效果。当ABA 的浓度为15µmol/L 时，缓解作用最佳，油菜幼苗的地上部鲜重、根系鲜重、地上部干重、根系干重、SPAD值以及根系活力分别较单独Cd 处理增加了36.41%、99.22%、44.01%、44.17%、27.60% 和92.26%（表3）。因此选择15µmol/L 作为后续ABA的处理浓度。

表3 不同浓度的ABA预处理后对镉胁迫下油菜幼苗生长的影响Table 3 Effects of different concentrations of ABA treatments on rapeseed growth

2.3 外源ABA对Cd胁迫下油菜根系形态的影响

由表4 可见，Cd 处理显著抑制了油菜根系的生长发育，总根长、总根表面积、总根投影面积、总根尖数、分枝数和交叉数均显著下降，与CK 相比分别降低57.78%、45.87%、50.51%、59.23%、29.58%和72.22%。相反，根平均直径较对照显著增加了17.65%。从根系形态的扫描图片也可直观看出20µmol/L Cd 处理后油菜幼苗根系生长严重受抑，与CK 相比，根系明显瘦小（图1）。表明，Cd 毒害会抑制根系伸长和侧根发育，同时导致根系膨大变粗。外源添加ABA处理后，Cd引起的根系伸长和侧根发育受抑程度显著减轻，总根长、总根尖数、分枝数和交叉数显著增加，与Cd 处理相比分别增加了73.22%、157.63%、74%和106.32%（表4，图1），表明ABA可以缓解Cd对油菜根系形态的损害。

表4 ABA预处理对镉胁迫下油菜根系生长的影响Table 4 Effects of ABA pretreatment on root morphology of rapeseed under cadmium stress

图1 不同处理条件下油菜根系生长情况表型Fig.1 Root phenotype of rapeseed under different treatments

2.4 外源ABA处理对油菜体内Cd含量的影响

由图2 可见，ABA+Cd 处理可显著降低Cd 在油菜地上部和根系中的积累。与单独Cd处理相比，添加ABA 后油菜地上部和根系中的Cd 含量分别下降了31.17%（图2A）和34.89%（图2B）。Cd 转运系数在处理间差异不显著（图2C）。

图2 ABA预处理对Cd胁迫下油菜体内Cd含量的影响Fig.2 Effects of ABA on Cd concentrations in rapeseed seedlings under Cd stress

2.5 外源ABA 处理对Cd 胁迫引起的油菜氧化损伤的影响

从图3A 可见，Cd 处理后油菜根系MDA 与对照相比显著增加，ABA+Cd 处理可显著降低MDA的积累，与Cd 处理相比下降了20.87%。H2O2和等活性氧的过量产生是Cd 胁迫导致氧化损伤的重要原因。Cd 处理下H2O2含量与CK 相比无显著变化（图3B），而O2·-含量显著增加，约是对照的131.37%，ABA 处理显著抑制了油菜根系中O2·-的过量积累，比单独Cd 处理下降了38.89%（图3C）。

图3 ABA处理对Cd胁迫下油菜根系活性氧含量的影响Fig.3 Effects of ABA on ROS contents in Cd-stresses rapeseed seedlings

2.6 外源ABA 处理对Cd 胁迫下油菜抗氧化酶活性的影响

由图4 可见，Cd 处理下，SOD 活性显著下降，CAT 活性显著增加，POD 活性无显著变化。外源添加ABA 后，SOD、CAT 和POD 活性分别比Cd 处理下分别增加了158.05%，28.59%和34.62%（图4），表明，Cd 处理干扰了抗氧化酶体系的运行，而ABA 可通过增强抗氧化酶的活性抑制活性氧的过量积累。

图4 ABA预处理对Cd胁迫下油菜根系抗氧化酶活性的影响Fig.4 Effects of ABA on the activities of antioxidant enzymes in rapeseed seedlings under Cd stress

3 讨论与分析

镉（Cd）胁迫会影响作物的生长和发育，导致作物的产量和品质下降，进而影响粮食和食品安全[3,19,24]。大量的研究表明，植物遭受Cd 毒害时首先表现为生长受抑和叶片萎黄，因而生物量和叶绿素含量常被用作评价植物遭受Cd 胁迫程度的重要指标[24～26]。本试验结果表明，油菜在低浓度（5 µmol/L）Cd 处理下生长影响不大，随着Cd 浓度的增加，便会显著抑制油菜幼苗的生长，主要表现为油菜幼苗的地上部和根系干鲜重、SPAD 值、根系活力等显著下降。这一结果与张大为等[27]的研究结果相似。脱落酸（ABA）是一种植物胁迫激素，也参与了植物对Cd胁迫的耐性响应[10,12,28～30]。例如，Cd胁迫处理能显著提高西红柿[14]、水稻[15]、柑橘[16]等植物内源ABA 的含量。同时，外源ABA 应用显著缓解了水稻[19]、小麦[20]、绿豆[18]、拟南芥[10]等植物的Cd 毒害症状，但是ABA 最佳的处理浓度因植物种类、栽培方式以及处理时间而异。本研究结果显示，5～20 µmol/L ABA处理不同程度缓解了Cd 对油菜幼苗生长的毒害作用，改善了叶片黄化和根系形态受抑程度，且浓度为15µmol/L时，油菜幼苗的地上部鲜重、根系鲜重、地上部干重、根系干重、SPAD 值以及根系活力等各项指标较单独Cd处理差异最为显著。因此，我们选择15 µmol/L 的ABA 处理进行后续试验，并且发现其作用可能是通过降低Cd 吸收积累和增强抗氧化酶活性，进而缓解Cd积累引起的氧化胁迫。

根系是植物最先与污染土壤接触的器官，也是植物遭受Cd 毒害的首要部位[3,31]。研究显示，植物根系可通过调整自身的形态来应对Cd毒胁迫，主要表现为主根伸长受抑，侧根和根毛发育不良等[32,33]。本试验结果显示，Cd处理后油菜幼苗的根系明显受损，总根长、总根表面积、根尖数、分枝数以及交叉数均显著下降，而根平均直径显著增加（表4 和图1）。根系生长和形态的损伤会阻碍其对水分和养分的吸收，进而导致地上部的生长受抑[32]。外源ABA 处理后，显著缓解了Cd 对油菜幼苗根系的损伤，总根长、根尖数、分枝数和交叉数显著增加（表4和图1），根系活力显著增加（表3）。在绿豆中的研究也发现，ABA处理可显著缓解Cd对根系生长的抑制作用，增加根系生物量和不定根的数量[18]。表明，ABA 处理有利于维持Cd 胁迫下油菜幼苗根系的生长和形态，进而改善地上部的生长，增强其对Cd 的耐性。

植物遭受Cd 胁迫程度常与植物体内Cd 积累量密切相关，在生产上采取措施降低Cd在植物体内的积累或转运则可以缓解Cd 对植物的毒害[33～36]。研究显示，ABA对植物体内Cd的吸收和转运具有调控作用[10,12]。例如，Fan 等[10]在拟南芥中的研究发现低浓度的ABA 应用可通过抑制二价铁转运体IRT1表达，减少根系对Cd 的吸收。在水稻中研究显示，外源ABA 处理可显著降低Cd 在水稻植株中的积累，这可能是通过降低蒸腾速率进而减弱Cd 转运实现的[19]。我们的研究结果显示，外源ABA 处理显著降低了Cd在油菜幼苗地上部和根系中的积累，但对于Cd 转运系数并没有显著影响（图2），表明ABA 很有可能是通过直接抑制油菜Cd 吸收降低其在植株体内的积累。但是，在油菜中ABA 具体是通过何种途径降低Cd吸收的尚不清楚，值得进一步探究。

镉在植物体内积累会引发一系列生理生化过程紊乱，其中活性氧（包括H2O2、O2·-和OH-等）的过量积累被认为是Cd 毒害的重要原因[11,37～38]。研究显示，ROS 过量积累会引起氧化胁迫，导致膜脂过氧化，细胞膜完整性破坏等，从而干扰细胞功能的正常行使[39]。本试验结果显示，Cd 处理后油菜幼苗根系MDA 含量较对照显著增加，而ABA 处理后则可显著降低由Cd 引起的MDA 含量增加（图3A），表明ABA 可以缓解油菜幼苗根系中由于Cd 引起的膜脂过氧化损伤。进一步测定ROS的含量显示，Cd处理下氧化损伤的产生主要是由于O2·-的大量产生引起，外源ABA 处理显著抑制了O2·-含量的增加（图4）。由此表明，外源ABA 处理缓解油菜幼苗Cd 毒害是由于其维持ROS稳态进而减轻氧化胁迫程度。

研究显示，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶直接参与了逆境条件下植物体内ROS 的产生和清除过程，在植物抵御逆境胁迫中具有重要的作用[38～40]。其中，SOD主要催化氧化活性较强的O2·-歧化成无毒的O2释放掉和毒性相对较弱的H2O2，而H2O2则进一步可在CAT 和POD 的作用下，分解为无毒的H2O 和O2，从而避免ROS 过量积累[22,39]。我们的试验结果显示，Cd 处理显著抑制了油菜根系SOD 酶的活性（图4A），这可能是O2·-过量积累的重要原因。而Cd 胁迫条件下H2O2没有显著积累的原因则可能是因为CAT 活性的增加（图4B）。外源ABA 处理显著提高了SOD 的活性，促进了O2·-歧化分解，与此同时，同步增加了CAT 和POD 活性，增强H2O2清除能力，避免了H2O2过量积累（图3 和4）。由此表明，外源ABA 应用可通过增强抗氧化酶系统中SOD、CAT 和POD 的活性提高油菜体内ROS 清除能力，缓解由ROS过量积累导致的氧化胁迫。

4 结论

综上所述，外源ABA 处理可显著缓解Cd 对油菜幼苗生长和根系形态的毒害作用，其主要机制是通过抑制Cd吸收和增强抗氧化酶活性，进而减少由Cd 积累引发的ROS 过量积累，减轻Cd 引起的氧化损伤和对植株的毒害作用。但是关于ABA 是如何影响Cd吸收的尚不清楚。此外，ABA是否与其他参与植物Cd 胁迫响应的植物激素或信号分子协同作用调控植物Cd 胁迫耐性？这些问题都有待进一步探讨，从而为用于Cd污染土壤安全利用的作物品种培育和栽培调控技术研发提供理论依据。