第一例栽培种花生花药培养单倍体植株的创制

谢永平，郑运欢，郭英铎，陈肇聪

（汕头市农业科学研究所，广东 汕头，515041）

花生（Arachis hypogaeaL.），是世界上重要的经济和油料作物。目前花生特异种质资源的匮乏成为其育种的瓶颈，因此种质的创新工作成为花生育种中亟待解决的问题[1]。

花药培养是20 世纪60 年代以来发展起来的一项生物技术，旨在诱导出单倍体花粉植株。花药培养属于器官培养范畴，是把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，诱导小孢子由正常的配子体发育途径转向孢子体发育途径，而后通过愈伤组织或胚状体再生单倍体植株的过程[2]。花药培养对于基础和育种研究都有重大意义，用杂种一代（F1）的花药进行培养，育出的单倍体使染色体加倍，得到纯合的个体，易于鉴定和选择，省时省工，大大提高选种效率[3]。利用花药培养产生单倍体植株的技术，已被广泛应用到28 科68 属170 多种植物上，其中23 科52 属约300 种高等植物的花药培养获得成功。花药培养技术在植物育种上具有缩短育种年限、提高育种效率、创建新种质资源等优点。花生花药培养研究最早报道始于1981 年，Bajaj 等用A.hypogaea和A.glabrata及A.villosa的单核后期的花药为外植体，经愈伤组织获得少量再生植株[4]。国内花生花药培养研究始于20 世纪70 年代初，但一直处于条件摸索和优化阶段，袁美等较系统地研究了基本培养基、基因型和蔗糖浓度等因素在花生花药愈伤组织诱导中的作用，以及几种激素组合在诱导愈伤组织及分化形成体胚中的作用[5]；张景景等对不同发育时期的花药进行固体培养，对诱导愈伤和愈伤分化的培养基进行了筛选[6]；但两项研究均未获得完整再生植株。

本研究以栽培种花生为材料，在花生单倍体育种工作进行前沿性探索试验。自2017 年3 月开始，通过比较灭菌时间、诱导培养基、分化培养基、再生培养基和植株再生培养条件等试验，筛选较为适合花生的花药愈伤组织诱导及分化培养基、植株再生培养条件，同时，对再生植株进行染色体数目鉴定，探讨桥梁品种对再生植株创制的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

所用花生材料见表1。2017 年3 月，在汕头市农业科学研究所官塘基地种植F3株系50份，在汕头市农业科学研究所花生育种基地种植F1组合14个，共64 份材料；5 月选取健康花生植株摘取未开放花蕾，花蕾淡绿色，花蕾规格约0.5 cm～0.7 cm，约在小孢子单核靠边期，每个株系（组合）取3～5 个花蕾。

表1 供试材料Table 1 Peanut materials used in the study

摘取花蕾次日，花蕾先用自来水冲洗20 min，在超净工作台上用75%乙醇浸泡30 s，接着放入1%NaClO（每100 mL 消毒液加1～2 滴表面活性剂Twenn-20）中消毒，设置三个处理时间：分别为7 min、9 min、11 min，然后用无菌水冲洗5～6 次，最后置于灭菌滤纸上吸干表面水分，剪除萼片，将花药块从花蕾中挤压出来，剔除花瓣、花柱。

1.2 愈伤组织诱导培养

设置诱导培养基4 种，分别为B5D1、B3D1、B5N1、B3N1（表2），培养基中添加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，pH 5.5～5.8。使用直径5 cm 广口玻璃瓶，每瓶倒入愈伤组织诱导培养基30 mL，经高压湿热灭菌、冷凝后接入已经消毒灭菌处理的花药，温度26±2℃黑暗培养20 d，统计花药的污染数、死亡数和愈伤组织数。

表2 愈伤组织诱导培养基Tabel 2 Media for calli induction

愈伤组织诱导率=（产生愈伤组织花药数/接种花药数）×100%

1.3 愈伤组织分化培养

设置分化培养基3 种，分别为B5N1-1、B5N1-2、B5N1-3（表3），培养基中添加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，pH 5.5～5.8。使用直径5 cm 广口玻璃瓶，每瓶倒入培养基30 mL，经高压湿热灭菌、冷凝后接入嫩绿色的愈伤组织，置于温度26±2℃、光照（2000 lux）8 h/d环境下培养30 d，统计愈伤组织分化率。

表3 分化培养基Tabel 3 Media for shoot induction

愈伤组织分化率=（能分化出幼芽的愈伤组织块数/转移愈伤组织块数）×100%

1.4 植株再生培养

将已分化出根、茎、叶的幼苗（高约4～6 cm，具有2～3 节间）接入CM 培养基、SG 培养基（表4，包含蔗糖20 g/L、琼脂5.5 g/L，pH 5.5～5.8），置于温度26±2℃、光照（2800 lux）10 h/d 光照培养箱中培养，15 d后记录再生苗的根数和叶数、再生植株数量。

表4 再生苗培养基Tabel 4 Media for intact plant regeneration

再生苗率=（再生苗数/接种已分化出幼芽的愈伤组织块数）×100%

再生植株率=（完整再生植株数/接种已分化出幼芽的愈伤组织块数）×100%

1.5 炼苗移栽

2018 年9 月，将两株再生植株（编号：15B8-6）带玻璃瓶放入炼苗棚进行自然光照培养30 d，株高约7～8 cm、茎基直径约0.2 cm、根5条或以上的小苗洗净晾干，置入1.5 寸（栽培基质为细沙∶珍珠岩=1∶1）塑料杯中，28±2℃、75%遮荫自然光下栽培。

2020 年10 月，以汕油121 为砧木、以再生植株（编号15B8-8）为接穗，嫁接部位为上胚轴，嫁接后用薄膜封闭并保持高湿度管理33 d，撤除薄膜炼苗15 d，嫁接成活后移植至田间，并搭建小拱棚覆盖薄膜保温栽培。

1.6 染色体鉴定方法

2020年11月，委托河南省作物分子育种研究院进行花生花药培养植株（编号：15B8-8）的染色体数目鉴定。

（1）花生根尖前处理：将根长1～1.5 cm 的主根及侧根根尖，放置于2 mmol/L 8-羟基喹啉（配置方法：0.029 g 8-羟基喹啉加入100 mL蒸馏水）中25°C处理3 h；将根尖取出用乙醇-冰醋酸（3:1）固定液（配置方法：30 mL 乙醇:10 mL 冰醋酸）进行固定，置于室温下约6 h后置于-20°C冰箱保存约12 h。

（2）染色体制片：采用根尖压片法。

（3）荧光原位杂交染色：花生A 和B 基因组特异探针[7]，A 基因组标记绿色，B 基因组标记红色；利用A 和B 基因组特异探针对15B8-8 根尖染色体进行荧光原位杂交染色。

（4）图片获取及分析：利用高分辨率荧光正置显微镜对杂交后片子照相，图片处理和染色体分析。

1.7 数据分析

采用Excel软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒时间对污染率、死亡率和诱导率的影响

花蕾经过1% NaClO 消毒处理，花药培养20 d后，出现三种情形：污染、死亡、诱导形成愈伤组织。由表5 可知，灭菌时间为7 min 时，污染率最高（11.5%）；消毒时间为9 min，死亡率降低、诱导率最高；消毒时间为11 min 时，污染率最低、死亡率最高、诱导率最低。因此，花药的消毒时间对愈伤组织诱导率有着较大影响，综合来看，1% NaClO 消毒时间9 min效果较好。

表5 外植体消毒时间对花药污染率、死亡率和愈伤诱导率的影响Table 5 Effect of disinfection period on rate of contamination，death and calli induction of anthers

2.2 诱导培养基对愈伤组织诱导率的影响

花药经过培养20 d 后（图1A），统计愈伤组织数。由表6 可知，B5N1、B3N1 培养基上的愈伤组织诱导率较高，分别达到81.3%、77.3%。因此B5N1、B3N1 培养基较B5D1、B3D1 培养基更适合花生花药诱导培养。

表6 诱导培养基对愈伤组织诱导率的影响Table 6 Effect of induction media on rate of calli induction

图1 愈伤组织诱导（A）和幼芽形成（B）Fig.1 Calli induction(A)and shoot formation(B)

2.3 分化培养基对芽分化的影响

愈伤组织接入B5N1-1、B5N1-2、B5N1-3培养基培养30 d 后调查分化率。由表7 可知，B5N1-2 培养基上的愈伤组织分化带幼芽组织数量较多（图1B），达到6个，分化率达4.26%，叶片和根形态更为明显、完整，较为适合花生花药愈伤组织再分化培养。

表7 分化培养基对分化率的影响Table 7 Effect of differation media on rate of shoot induction

2.4 再生培养基对再生苗生长的影响

将已分化出幼芽的愈伤组织块接入CM 培养基、SG培养基15 d后，少数能继续生根生叶，且根叶形态趋于正常（图2）。由表8可知，两种培养基上的再生苗根数、叶数差异很小，SG 培养基的再生苗全部出根，CM 培养基的再生苗出现了有叶无根的不良生长效果，因此，SG培养基比CM培养基更适合再生苗根叶生长。

图2 再生植株生长情况Fig.2 Status of regenerated plants

表8 再生培养基对再生苗生长的影响Table 8 Effect of regeneration media on growth of shoots

2.5 外植体世代对再生植株创制的影响

由表9 可知，试验共培养64 份材料，其中F1世代有14份，F3世代有50份材料。F1世代材料的愈伤组织诱导率为69.8%，芽分化率为2.27%，获得再生苗1株，无再生植株，再生苗率和再生植株率分别为50%、0；F3世代材料的愈伤组织诱导率为70.7%，芽分化率为2.99%，获得再生苗5 株、再生植株4 株，再生苗率和再生植株率分别为50%、40%。综上所述，在愈伤组织诱导、芽分化和再生苗方面，F1世代与F3世代之间差异很小；从F1世代只获得1 株再生苗，与F3世代比较再生植株率，由于样本太小存在较大误差，不具备可比性。

表9 供体植株世代对再生植株创制的影响Table 9 Effect of generation of donor plants on establishment of plant regeneration

2.6 基因型对再生植株创制的影响

由表10 可知，试验共有64 个株系（组合）进行花药培养，其中有23 个株系（组合）亲本包含汕油52，愈伤组织诱导率69.2%、芽分化率5.56%，获得再生苗5 株、再生植株4 株，再生苗率71.4%、再生植株率57.1%；另外，有41 个株系（组合）亲本未包含汕油52，愈伤组织诱导率71.1%、芽分化率1.68%，获得再生苗1 株、再生植株0 株，再生苗率20.0%、再生植株率为0。

表10 基因型对再生植株率的影响Table 10 Effect of genotype on rate of plant regeneration

由表11 可知，试验获得再生苗6 株，其中株系15B5-7、15B8-6、15B8-8 分别为1 株、2 株、2 株，组合16B13 为1 株；获得再生植株4 株，15B8-6、15B8-8 等二个株系各2 株。其余株系（组合）的花药愈伤组织均未出现分化。获得再生苗的4个株系（组合）中3 个株系（组合）的亲本包含汕油52；有2 个株系获得再生植株，均为15B8 组合（粤油256/汕油52）F3世代株系，汕油52是父本。

表11 再生植株的统计Table 11 Description of regenerated plants

综合对比可以发现，汕油52 花生品种，无论是作为父本、母本，世代数在F1、F3，都具有较强的花药培养力。

2.7 移栽结果

2018 年移栽过程中，由于环境变化剧烈导致2株再生植株（编号15B8-6）死亡；2020 年嫁接成活后，1 株再生植株（编号15B8-8）成功移植田间栽培（图3）。

图3 再生苗的嫁接（A）、炼苗（B）和田间移植（C）Fig.3 Grafting(A),acclimation(B)and transplanting(C)of regeneration shoot

2.8 染色体鉴定结果

结果如图4。依据荧光原位杂交染色结果可以看出，花生花药培养材料染色体总数为20，A基因组（绿色）染色体条数为9，B基因组（红色）染色体条数为11条。花生栽培种染色体条数为40，与栽培种相比较来看，该材料为单倍体。

图4 花药单株的倍性鉴定FISH检测图：有丝分裂中期（A）和前期（B）Fig.4 Haploid identification of plants from anther culture by FISH:metaphase(A)and prophase(B)of mitosis

3 讨论

Mroginski 和Ternandez 在1980 年曾报道用花药培养得到两个二倍体野生种幼苗，但在花生栽培种上尚未见成功的报道［8］。国内有关花生花药培养的报道极少，只有山东省花生研究所的袁美等与河北农业大学的张景景等进行过研究报道，但均未获得完整再生植株[5，6]，2012 年以来，国内未见花生花药培养的报道。由此看来,由花生花药培养获得单倍体植株十分困难[5]。

本研究中，花生花药愈伤组织诱导率为56.0%～81.3%，愈伤组织分化率为1.42%～4.26%，再生苗率20.0%～100%，再生植株率0%～100%。综合来看，1%NaClO 消毒灭菌时间9 min，诱导培养采用B5N1、B3N1 培养基，分化培养采用B5N1-2 培养基，再生苗生长采用SG 培养基，从接种花药到获得再生植株，成功的概率为0.67%。

编号为15B8-8（F3）的再生植株，经根尖染色体鉴定，具有9 条A 染色体、11 条B 染色体，而不是理论上的10 条A 染色体、10 条B 染色体，推测分裂期间可能进行了染色体交换，确切原因尚有待进一步探讨。此外，由于完整再生植株数量极少，暂时没有条件做其他染色体鉴定方法，待植株扩繁足够多，可以采用细胞流氏仪进行倍性鉴定。

需要说明的是，本研究自2017 年3 月开始，进行多次花生花药培养，除了2017年春季试验获得完整再生植株，其他试验均没有获得再生植株，花生花药培养技术体系仍不完善，还需进一步优化。究其原因，一是后来的试验取样共50 朵花蕾左右，规模太小；二是课题组没有专职试验人员，无法长期坚持高强度研究；三是卡在最为关键的再分化培养环节。

在花药培养力较强的基因型上，花药培养方法具有许多优点，包括手续简便、效率高和集约化等。某一特定的品种，它本身的花粉植株的诱导率并不高，但是当它作为杂交亲本之一时，杂种一代的花粉愈伤组织的诱导率都相当高，这样的品种通常称为花药培养的“桥梁品种”[9]。

综合对比可以发现，汕油52 花生品种，无论是作为父本、母本，世代数在F1、F3，都具有较强的花药培养力，因为只有一次试验，能否成为花生花药培养的“桥梁品种”，尚有待进一步探讨。

移栽过程中，由于环境变化剧烈导致15B8-6的两株完整再生植株死亡，未能开展后续研究。此后，课题组采用嫁接的方法，15B8-8 单倍体植株成功移栽在室外。

4 结论

此次研究在花生花药培养方面取得突破性进展，首次在花生学科领域花生栽培种上获得单倍体植株，编号为15B8-8 的完整再生植株，经根尖染色体鉴定，具有9 条A 染色体、11 条B 染色体，是第一例栽培种花生花药培养单倍体植株。利用花药培养单倍体植株构建成的DH 群体，是遗传连锁图谱构建和进行QTL 定位等方面研究的理想群体，可以为花生基因定位和功能基因的发掘奠定物质基础，为花生研究与育种提供了新的思路和途径。

致谢：感谢山东花生研究所袁美博士在文章修改和倍性鉴定方面的指导、感谢汕头大学钟名其博士在培养基选择方面的指导、感谢河南省作物分子育种研究院杜培博士在倍性鉴定方面的协助！