伴H3K27M突变的脊髓弥漫性中线胶质瘤的临床病理特征和预后

吴小延 黄超芸 罗威 王芳 杜紫明 邓玲★

根据2016年世界卫生组织（World Health Or⁃ganization，WHO）分类，在H3F3A或HISTIH3B/C中具有H3K27M突变的弥漫性中线胶质瘤被认为是一种新的实体，称为“弥漫性中线胶质瘤，H3K27M突变体”［1］。它主要发生在丘脑、脑干和脊髓等中线结构。以往文献报道了弥漫性中线胶质瘤，H3K27M突变体在大脑的中线结构中，包括成人的丘脑和脑干；鲜有报道脊髓弥漫中线胶质瘤H3K27M突 变病例［2⁃3］。因此，迫切 需要根据2016年WHO 分类从患者中总结脊髓弥漫中线胶质瘤H3K27M突变体的特征和预后因素。本研究分析2017年至2021年在中山大学附属肿瘤医院确诊的13 例脊髓弥漫中线胶质瘤患者的临床、分子病理特征和预后因素。以更全面地了解脊髓弥漫中线胶质瘤，并为其管理提供询证实践。

1 材料与方法

1.1 临床资料

评估2017年11月至2021年9月期间在中山大学附属肿瘤医院手术且经病理确诊为脊髓弥漫中线胶质瘤的13 名患者的临床结果见表1。患者平均年龄为（27.5±14.4）岁，76.9%（10/13）的患者为成人（≥18 岁）。平均随访时间为15.3 个月（1.7～34个月），其中男性10 例，女性3 例，男性占优势。肿瘤的发生频率依次为胸椎（30.8%），胸腰椎（30.8%），腰椎（15.4%），颈椎（15.4%），颈胸椎（7.7%）。纳入标准：①所有患者均根据2016年WHO 分类明确组织病理学诊断为脊髓弥漫中线胶质瘤；②H3K27M均为突变状态；③可获得患者的随访信息。排除标准：①脊髓以外部位的胶质瘤患者；②H3K27M野生状态；③术后失访的患者。本研究经院医学伦理委员会批准，且获得所有患者知情同意。

表1 13 例脊髓弥漫中线胶质瘤患者的病理特征Table 1 Pathological characteristics of 13 patients with diffuse midline glioma of the spinal cord

1.2 方法

组织病理学分级是通过苏木精和伊红（H&E）染色对福尔马林固定/石蜡包埋（Formalin fixation/paraffin embedding，FFPE）样本进行常规评估来确定的。所有切片均由至少两名经验丰富的病理学家进行审查。免疫组织化学染色采用Envision 法，单克隆抗体选用胶质纤维酸性蛋白（Glial fibril⁃lary acidic protein，GFAP）购自北京中杉金桥生物技术有限公司（0.2 mL/支，21030609）、Olig⁃2购自福州迈新生物技术开发有限公司（0.2 mL/支，2106240681C3）、ATRX购自福州迈新生物技术开发有限公司（0.2 mL/瓶，2107290855C2）、P53购自苏州百道医疗科技有限公司（0.2 mL/瓶，PA21061A01）、H3K27M购自基因科技（上海）有限公司（0.2 mL/瓶，2021051401）、Ki⁃67购自丹麦Da⁃ko 公司（12 mL/瓶，41282723）。采用罗氏公司BenchMark XT 全自动免疫组织化学仪器染色。1p/19q共缺失通过荧光原位杂交（fluorescence in si⁃tu hybridization，FISH）技术进行检测，FISH探针购自广州安必平医药科技股份有限公司，包括1q21/L 1p36和19p13/19q13 两组探针（5 人份/盒，202112001），采用Olympus BX51 荧光显微镜观察结果。

1.3 基因突变分析

采用FFPE 样本DNA 分离提取试剂盒（基因科技股份有限公司，50 次测试/盒，批号：2021111801）提取组织DNA，严格按照试剂盒说明书步骤进行操作。对抽提后的DNA 进行PCR 扩增后，通过Sanger 测序检测H3F3A/HIST1H3B K27M、IDH1R132H 以及TERT启动子C228T 和C250T 突变；其中TERT采用巢式PCR 的方法进行扩增，使用的引物序列见表2。按25 μL PCR 体系进行扩增。H3F3APCR 反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环10次；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30 次；72℃延伸5 min，12℃保温。IDH1PCR 反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环32 次；72℃延伸5 min，12℃保温。TERTPCR 反应程序为：94℃预变性5 min，98℃变性10 s，75 ℃退火1 min，循环30 次；98℃变性10 s，58℃退 火15 s，68℃延 伸1 min，循环35 次；72℃延伸5 min，12℃保温。扩增后的PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。Sanger 测序利用测序试剂盒中bigdye mix，利用设计好的测序引物，于ABI 3500XL 型测序仪进行测序。

表2 H3/IDH1 基因引物序列Table 2 H3/IDH1 gene primers sequence

1.4 随访方法

通过电话联系脊髓弥漫中线胶质瘤患者并询问患者的状态，采用中山大学肿瘤防治中心病案管理系统，通过查阅病历对患者进行了随访，随访内容包括性别、年龄、组织学分级及肿瘤部位。生存时间定义为从手术日期到最后一次随访或死亡日期。

1.5 统计学方法

采用统计软件R 语言对数据进行统计分析；预后因素和生存情况采用Kaplan⁃Meier 和log⁃rank检验以及单变量Cox 回归对结果进行比较分析；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分子病理特征

免疫组织化学染色显示，13 例病变中，所有肿瘤细胞呈H3K27M核阳性表达（以血管内皮细胞为阴性内对照），阳性率为100%（100/100），见图1。基因检测结果显示，13 例患者出现基因突变，与免疫组织化学阳性病例完全吻合，突变基因均为H3F3ANM_002107.4：c.80A>T（p.K27M），见图2。其他分子特征示瘤细胞不同程度的表达，11 例患者进行了P53检测，强阳性表达者9 例（81.8%）；10 例进行ATRX检测，结果显示8 例ATRX表达缺失（80.0%）；13 例患者进行GFAP及Olig⁃2检测，结果显示两个均有不同程度阳性；10 例进行1P/19Q共缺失检测，结果显示10 例（100%）1P/19Q均阴性；Ki⁃67阳性指数为1%～40%。10 例患者IDH1基因检测均阴性；8 例患者TERT启动子基因检测均阴性。见表3。

图1 脊髓弥漫中线胶质瘤病理特征Figure 1 Pathological characteristics of diffuse midline glioma of the spinal cord

图2 H3K27M基因点突变NM_002107.4：c.80A>T（p.K27M）Figure 2 H3K27M gene point mutation NM_002107.4：c.80A>T（p.K27M）

表3 13 例脊髓弥漫性中线胶质瘤的分子特征Table 3 Molecular characteristics of 13 cases of diffuse midline glioma of the spinal cord

2.2 生存分析

在本研究中，有3 名患者表现出肿瘤扩散。13 例患者的生存率为69.2%，中位生存时间为13.0 个月（1.7～34 个月），随访期间4 例患者死亡。13 例脊髓弥漫中线胶质瘤患者的1、2年生存率分别为61.5%、15.4%，见图4A。组织学分级Ⅰ/Ⅲ和Ⅳ级肿瘤患者的中位总生存时间比较，两者差异无统计学意义（P>0.05）（图4B）。排除颈脊髓弥漫中线胶质瘤患者后，中位总生存时间为15.3 个月，而在包括所有脊髓胶质瘤患者后，中位生存时间为13.0 个月，两者差异有统计学意义（P<0.05）（图4C）。此外，7 名患者（53.8%）接受了替莫唑胺治疗，而接受替莫唑胺治疗的患者较未接受替莫唑胺治疗的患者平均生存时间长4.5 个月；差异无统计学意义（P>0.05）。见图4D。

图4 13 例脊髓弥漫中线胶质瘤患者的生存曲线Figure 4 Survival curves of 13 patients with diffuse midline glioma of the spinal cord

2.3 COX 单因素分析

当年龄、性别、肿瘤位置、WHO 分级和替莫唑胺治疗被纳入Cox 模型时，排除颈髓病变患者的因素与脊髓弥漫中线胶质瘤的预后之间的差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 脊髓弥漫中线胶质瘤的单因素相关分析Table 3 Single factor correlation analysis of diffuse midline glioma of the spinal cord

3 讨论

由于脊髓胶质瘤的罕见性，其治疗仍存在争议，也没有建立专门的治疗指南［1］。本研究根据病理分级比较了中位总生存时间WHOⅠ/Ⅲ级和WHOⅣ级肿瘤患者，尽管两种级别的肿瘤患者的生存率差异无统计学意义，但WHOⅠ/Ⅲ级胶质瘤患者的生存期更好，中位总生存时间为15.2 个月，而WHOⅣ级胶质瘤患者的中位总生存时间为13.0 个月。本研究结果与之前的研究，替莫唑胺可降低脊髓胶质瘤患者术后复发率和死亡率结果一致［4］。此外，本研究通过排除或包括颈髓病变的患者来比较生存率，两者差异有统计学意义。同样，Toshitaka Se⁃ki1［5］等人报道，排除颈髓病变患者与包括颈髓病变的所有患者预后差异有统计学意义，Nakamura［6］等人报道，颈髓肿瘤患者的预后明显低于胸脊髓肿瘤患者。以上研究提示颈髓病变因素与脊髓弥漫中线胶质瘤预后存在相关性。

分子研究的最新进展显示，包括IDH1突变、1p/19q共缺失、H3K27M突变、TERT启动子突变等基因，彻底改变了诊断胶质瘤的分类和精准化治疗［2］。然而，与脑胶质瘤相比，以往关于脊髓胶质瘤的研究单篇报道比较罕见，脊髓胶质瘤的分子特征仍然很大程度上未知［5，7⁃8］。本研究13 例脊髓弥漫中线胶质瘤的分子研究显示，IDH1突变率0%（0/10），ATRX和P53分别为80.0%（8/10）和81.8%（9/11）。与之前的文献相符合［9⁃11］。有研究提示TERT启动子突变与IDH1野生型脊髓胶质瘤的存活率低有关［12］。本研究发现8 例TERT启动子全部无突变。另外，本研究也揭示分子谱的同质性，例如所有IDH1及TERT阴性，无1p/19q共缺失。

此外，本研究注意到H3K27M突变型脊髓弥漫中线胶质瘤的中位年龄为31 岁（11～56 岁），H3K27M突变型脊髓弥漫中线胶质瘤的中位总生存时间为13 个月，这与之前的报道一致，但与脑干星形细胞瘤有显着差异，脑干细胞瘤主要发生在青少年中，中位总生存时间小于12 个月［13］。以上结论说明控制发育的遗传因素在脑干和脊髓星形细胞瘤存在差异，并可能为治疗策略提供特定位置的分子靶点。

综上，虽然H3K27M突变被认为是弥漫性中线胶质瘤的有力标志物，但研究证明在评估H3K27M突变脊髓星形细胞瘤的预后时不能忽视颈髓病变患者。本研究结果为改善脊髓弥漫中线胶质瘤的管理提供了基于证据的信息。本研究的局限性包括其回顾性设计，并且由于样本数量小，缺乏可用样本进行充分分析，这可能会引入选择偏差。未来有必要通过大规模数据分析来证实脊髓弥漫中线胶质瘤的特异性，并为髓弥漫中线胶质瘤的临床治疗寻找新的分子标志物。