自贡冷吃兔主要原辅料中细菌的鉴定及溯源分析

袁先铃，郑贻丹，罗燚，林洪斌

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644005）（2.西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039）

自贡冷吃兔，是自贡乃至川南地区的一种特色传统肉制品，以鲜兔肉为原料，辅以辣椒、花椒、姜等香辛料，经预煮、腌制、炒制等工艺加工而成[1]，其色泽亮黄，具有川菜特有的麻辣鲜香，嚼劲十足且爽口不绵。2014年，自贡冷吃兔成为国家地理标志保护产品，2020年，发布行业标准《地理标志产品自贡冷吃兔》[2]。以兔肉为原料的自贡冷吃兔产品营养丰富，但自贡冷吃兔加工与生产环节为开放式，并且多采用巴氏杀菌，容易出现微生物污染，导致产品在流通、储藏过程中易腐败变质，造成自贡冷吃兔货架期短，从而限制了企业的发展、产品的流通销售等。

作为自贡冷吃兔的原料兔肉，近年来颇受大众欢迎，是人们摄取营养物质的优秀来源[3-5]。目前，兔产业因新冠疫情有所影响，但肉兔产业预计将继续维持上升趋势，兔产业整体发展也将持续上升[6]。研究调查显示中国对兔肉的消费主要取决于加工水平，而在国外更加在意兔肉的来源[7]。目前对兔肉的研究主要集中在提升兔肉品质[8,9]，兔肉结构特性[10]分析以及兔的饲养[11]等。在熟肉中常见污染微生物有乳酸菌、肉毒梭状芽孢杆菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、热杀索丝菌和大肠杆菌等[12-14]。李冉等[15]对气调包装狮子头冷藏过程中微生物变化及菌群结构分析，发现狮子头腐败时期的菌群结构主要肠杆菌属（Enterobacterspp.）、乳酸菌属（Lactobacillusspp.）以及嗜冷杆菌属（Psychrobacterspp.）等组成。彭先杰等[16]发现腐生葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、鸡葡萄球菌和枯草芽孢杆菌是香辣仔鹅的特征腐败菌。在冷吃兔整个生产工艺中，生产原辅料是主要的微生物污染来源，其原带菌数是生产工艺中关键控制点，原辅料本身就存在卫生状况较差的现状，风险较高，不仅可能造成终产品的食品安全问题，还有存在交叉污染的风险，因此要严格把控原辅料带菌数，从源头降低微生物污染[17-19]。

本研究对自贡冷吃兔的原料和主要辅料中的微生物数量进行测定，采用传统培养法结合16S rDNA测序技术鉴定，确定原料和各种辅料中细菌的主要种属，建立潜在污染细菌库，并进行溯源分析。为从冷吃兔生产源头控制细菌种类与数量提供理论依据，从而延长自贡冷吃兔的货架期，扩大产品的流通范围。同时，也为川菜工业化产品细菌控制提供参考，为川菜产品走向全国、乃至全世界提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷鲜兔、辣椒、花椒、八角、芝麻、孜然、山奈、香料、桂皮、生产用水，自贡市某食品有限公司；氯化钠（分析纯），上海源叶生物科技有限公司；PCA平板计数琼脂、Baird-Parker琼脂基础、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）、MRS培养基、LB培养基、亚蹄酸盐卵黄增菌液，青岛海博生物技术有限公司；甘油，上海麦克林生化科技有限公司；1×TSE101金牌mix、TSINGKE高纯度低电渗琼脂糖、DNA凝胶回收试剂盒、DL5000 Marker，Tsingke公司。

HLD-30002型电子天平，杭州友恒称重设备有限公司；DK-98-11型万用电炉，北京科伟永兴仪器有限公司；LS-75HD型立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司；101-3AB型数显恒温鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司；DZKW-D-2型电热恒温水浴锅，上海科恒实业发展有限公司；Hws-250B型恒温恒湿培养箱，天津市宏诺仪器有限公司；SW-CJ-2FD型净化工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；QYC-2102型双层小容量全温恒温摇床，上海福玛试验设备有限公司；3730XL型测序仪，Applied Biosystems；Legend Micro17型离心机，Thermo；2720 thermal cycler型PCR仪，Applied Biosystems；JY300C型电泳仪、JYDF(定制)型电泳槽、JY04S-3C型凝胶成像仪，君意东方；DFD-700型水浴锅，北京中兴伟业；L550型板式离心机，cence湘仪。

1.2 试验方法

1.2.1 取样及处理

1.2.1.1 样品来源

真空冷吃兔样品及冷吃兔生产原料取自自贡市某食品有限公司，未添加任何防腐保鲜剂，采用同一批次随机取样，每一种原料或辅料，设立三个平行，在真空密封低温的条件下运输至实验室检测及保存。

1.2.1.2 真空包装冷吃兔生产工艺流程

选择原辅料→兔肉切丁→焯水→腌制→炒制→真空包装→灭菌→成品

1.2.1.3 腐败样品预处理

将样品置于25 ℃贮藏至产生气泡、胀袋，得到腐败终点样品。

1.2.2 原辅料的数量测定

参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[20]、GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[21]、GB 4789.41-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验》[22]和GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[23]对原辅料进行菌落总数、乳酸菌数量、肠杆菌数数量、金黄色葡萄球菌数量测定。

表1 细菌的培养条件 Table 1 Bacterial culture conditions

1.2.3 原辅料细菌的分离纯化

挑选菌落数量测定后菌落数量在30～300的培养基，观察菌落的颜色、大小、形态、边缘结构、隆起程度、光泽度及透明度等特征。挑选典型菌落，进行革兰氏染色，在显微镜下观察，并进行划线分离纯化，至少进行3次划线，直至得到纯化单菌落。挑取纯菌落于LB培养基中，过夜培养，加入终浓度为20%的甘油，-20 ℃保藏、备用。

1.2.4 细菌的分子鉴定

1.2.4.1 扩增与测序

取1 mL保藏的菌液转接于LB培养基，37 ℃过夜培养，4 ℃，8000 r/min离心10 min，弃上清，获得细菌菌体沉淀。采用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型）提取纯化菌株的DNA，以提取的DNA样品作为模版，采用16S rDNA细菌通用引物27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’为引物，PCR扩增反应体系为25 µL：上下游引物各1 µL，模版2 µL，10 µL 2×Tap Master Mix，补ddH2O至25 µL。反应程序为：98 ℃预变性2 min，38个循环（98 10 s℃ ，55 ℃15 s，72 15 s℃ ），72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.2.4.2 16S rDNA序列同源性分析

将返回的16S rDNA基因测序结果通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库对各菌株进行Blast相似序列检索，一般来讲，在种分类等级上，如果2个分类单位间的16S rDNA序列同源性大于97.5%，则认为属于同一个种。

1.2.4.3 系统发育树的构建

以确定的细菌16S rDNA序列为构建系统发育树的参考菌株，用未知序列与已知序列进行序列对比后，通过MEGA X软件中Neighbor Join法构建系统发育树。

1.3 数据处理

每组试验均进行3次及以上平行测定，采用Microsoft Excel 2016、SPSS Statistics 22和Oringin 2019对试验数据进行处理、统计和制图。

2 结果与讨论

2.1 不同原辅料中细菌数量分析

由表2主要原辅料细菌检测结果可知：不同原辅料菌落总数从大到小为：兔肉＞孜然＞辣椒＞香料＞生产用水＞山奈＞八角＞桂皮＞花椒＞芝麻；未在生产用水中检出乳酸菌属细菌，其余原辅料中均检出乳酸菌属细菌，其中兔肉、辣椒、孜然、香料含乳酸菌数目大；金黄色葡萄球菌存在于兔肉、辣椒、孜然、山奈、香料，其中兔肉中高达6.02 lg(CFU/g)；肠杆菌属细菌在兔肉、辣椒、孜然、香料中检出，兔肉与孜然中肠杆细菌含量高。生产所用原辅料中，兔肉、辣椒、孜然、香料带菌量大，且均存在乳酸菌、金黄色葡萄球菌、肠杆菌；花椒、八角、芝麻、桂皮中主要存在乳酸菌，山奈中存在乳酸菌和金黄色葡萄球菌；生产用水虽未检出乳酸菌、金黄色葡萄球菌、肠杆菌，其菌落总数为2.89 lg(CFU/mL)（GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》规定车间生产用水菌落总数应≤100 CFU/mL且不得检出大肠菌群[24]）。自贡冷吃兔生产所用兔肉、辣椒、孜然、香料为潜在细菌污染源，生产用水超标，采用超标的生产用水清洗，可能对兔胴体起不到清洗减菌作用，且会增加交叉污染的可能性。应当严格控制原辅料的采购，对运输、储存、生产条件进行标准、规范、卫生管理。

表2 主要原辅料细菌检测结果 Table 2 Bacterial detection results of main raw materials

2.2 细菌生理形态特征分析

通过4种选择培养基对自贡冷吃兔生产原料及各种辅料中的细菌进行稀释涂布筛选，至少3次平板划线得到单菌落，共分离到76株菌，针对每种原辅料选取菌落数量最多的菌株进行菌落形态特征描述，见表3。

表3 原辅料中部分细菌的菌落形态特征 Table 3 Colony morphological characteristics of some bacteria in raw materials

2.3 16S rDNA PCR扩增产物电泳图谱

采用通用引物27F/1492R对76株菌16S rDNA扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，其中部分菌株电泳图如图1。

图1 部分菌株16S rDNA PCR扩增产物电泳图谱 Fig.1 Electrophoresis patterns of 16S rDNA PCR amplification products of some strains

如图1所示，电泳图谱显示均得到大约1500 bp的PCR扩增片段，条带明亮清晰，满足后续测序要求，随后进行测序。

2.4 鉴定结果

用ContigExpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分，将拼接好的序列在NCBI数据库（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对，选取同源性（≥99%）最高的菌株序列，结果如表4至11所示。

2.4.1 原料兔肉中的主要细菌

由表4可知，从冷鲜兔中分离出的11株菌，分布于8个属，其中2株（菌株号TR1、TR5）与土生拉乌尔菌（Raoultella terrigena）[25]相似度高达99%、TR2与扩展短杆菌（Brevibacterium linens）[26]相似度高达99%、TR3为蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）[27]、TR4为河生莱略特氏菌（Lelliottia amnigena）[28]、TR6为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）[29]、TR7为液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）[30]、TR9为Empedobacter falsenii[31]、2株（TR8、TR11）解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica）[32]、TR10为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）[33]。

表4 冷鲜兔肉中主要细菌的鉴定 Table 4 Identification of main bacteria in chilled rabbit meat

2.4.2 辣椒中的主要细菌

从辣椒中分离到10株菌，属于4个属，其中2株（LJ4、LJ8）鉴定为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）[34]，2株（LJ6、LJ10）肠杆菌（Enterobactersp）[35]，LJ1为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）[36]，LJ2为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[37]，LJ3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[38]，LJ5为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）[39]，LJ7为Siccibacter colletis[40]，LJ9为栖热菌（Thermussp）[41]。

2.4.3 花椒与八角中的主要细菌

从花椒中分离得到4株菌，分布于2个属，HJ1为水管致黑栖热菌（Thermus scotoductus）[42]，HJ2为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）[43]，HJ3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[38]，HJ4为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）[44]。

从八角中分离到8株菌，属于2个属，2株（菌株号BJ6、BJ7）与巨大芽孢杆菌相似度最高，BJ1为芽孢杆菌（Bacillussp）[45]，BJ2为水管致黑栖热菌（Thermus scotoductus）[42]，BJ3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）[46]，BJ4为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）[47]，BJ5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[38]，BJ8为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）[48]。

2.4.4 芝麻和孜然中的主要细菌

从芝麻中分离到3株菌，分别鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）[47]，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）[49]，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[37]。从孜然中分离到4株菌，分别为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）[50]，Siccibacter colletis，阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）[36]，考氏科萨克氏菌（Kosakonia cowanii）[51]。

表5 生产所用辣椒中主要细菌的鉴定 Table 5 Identification of main bacteria in pepper used in production

表6 生产所用花椒与八角主要细菌的鉴定 Table 6 Identification of main bacteria in prickly ash and aniseed used in production

表7 生产所用芝麻和孜然主要细菌的鉴定 Table 7 Identification of main bacteria of sesame and cumin used in production

表8 生产所用山奈中主要细菌的鉴定 Table 8 Identification of main bacteria of Sanai used in production

2.4.5 山奈中的主要细菌

从山奈中分离纯化得到6株菌，全属于芽孢杆菌属（Bacillussp），其中SN1与SN5枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[38]，SN2为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）[39]，SN3、SN4为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）[52]，SN6为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[37]。

2.4.6 香料中的主要细菌

从香料中分离出15株菌，属于3个属，其中3株（XL6、XL7、XL11）为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[38]，3株（XL2、XL14、XL15）属于Mixta calida，2株（XL1、XL9）热生泛菌（Pantoea calida）[53]，XL4为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）[54]，XL5为芽孢杆菌（Bacillus sp）[45]，XL8为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）[47]，XL10为克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）[55]，XL12为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）[56]，XL12为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[37]。

2.4.7 桂皮中的主要细菌

从桂皮中分离纯化得到12株菌，属于2个属，其中4株（GP1、GP5、GP6、GP11）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[38]，GP2为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）[47]，GP3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）[52]，GP4为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）[39]，GP7为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）[56]，GP8为死亡谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）[57]，GP9为栖热菌（Thermus scotoductus）[41]，GP10高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）[58]，GP12为东京芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）[59]。

2.4.8 生产用水中的主要细菌

从生产用水中分离3株菌，分别为类芽孢杆菌（Paenibacillussp）[60]，离中不粘柄菌（Asticcacaulis excentricus）[61]，沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）[62]。

表9 生产所用香料中主要细菌的鉴定 Table 9 Identification of main bacteria of fragrances used in production

表10 生产所用桂皮中主要细菌的鉴定 Table 10 Identification of main bacteria of cinnamon used in production

表11 生产用水主要细菌的鉴定 Table 11 Identification of main bacteria in production water

表12 腐败冷吃兔中细菌鉴定结果 Table 12 Bacteria identification results in spoilage Leng-Chi rabbits

2.4.9 腐败冷吃兔中的细菌

从腐败终点样品（25 ℃贮藏至产生气泡、胀袋）共筛选16株菌，分属于3个属，11株（FB-1、FB-2、FB-4、FB-6、FB-7、FB-8、FB-9、FB-12、FB-14、FB-15、FB-16）表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）[63]、1株（FB-5）地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[64]、1株（FB-3）Rummeliibacillus stabekisii[65]、2株（FB-10、FB-11）Bacillus paralicheniformis[66]、1株（FB-13）蔬菜芽孢杆菌（Bacillus oleronius）[67]。

2.5 腐败细菌与原辅料细菌同源性分析

将从腐败冷吃兔筛选得到的16株腐败菌和原辅料中细菌进行多序列比对，采用NJ法构建系统发育树，去除低置信度分支。根据图2可知，从腐败样品中分离的芽孢杆菌属细菌Bacillus licheniformis、Bacillus paralicheniformis分别与芝麻（在炒制结束时加入，未达到完全灭菌状态）中的细菌Bacillus licheniformis、山奈中的细菌Bacillus licheniformis处于一个分支，且具有较高同源性，说明了真空包装自贡冷吃兔芽孢杆菌属细菌的污染极有可能来源于辅料芝麻和山奈。芝麻含有大量的脂肪和蛋白质，追溯生产工艺发现芝麻是先经行炒熟再在自贡冷吃兔炒制末尾时加入，而此时炒制温度逐渐降低，存在潜在污染风险；山奈具有药食两用的特点，含有丰富的活性物质，需放置干燥通风处，在工厂生产时可能由于储存不当而导致污染。腐败样品中葡萄球菌属细菌与生产用水中Staphylococcus warneri同源性高，表明生产用水是冷吃兔产品葡萄球菌属细菌重要的污染来源，通过分析发现是由于生产厂家对生产用水进行了储存，在储存期间导致生产用水受到沃氏葡萄球菌污染。冷吃兔产品经100 ℃杀菌处理25 min以后，其贮藏期能达到10周，而Bacillus licheniformis耐热性极强，其生长不受处理时间和温度影响[68]；Bacillus paralicheniformis在高温处理后，依然有良好的耐受性，存活率均在60%以上[69]；Staphylococcus warneri耐热性强，巴氏杀菌条件下不易杀死[70]。

图2 腐败细菌与原辅料细菌同源性系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree of homology between spoilage bacteria and raw material bacteria

在生产工艺中，选择带菌量少的原辅料不仅可以从源头降低微生物污染，还可以有效防止交叉污染；对原辅料进行清洗、焯水时，应选择纯净水，减少水源二次污染；通过腌制、炒制、灭菌可将原辅料中大部分细菌杀灭，但少量细菌耐受性较强，仍会导致自贡冷吃兔产品保质期不长，可针对性的对部分辅料进行灭菌后再使用。

3 结论

3.1 通过对自贡冷吃兔生产所需的原料兔肉及主要辅料：辣椒、花椒、八角、芝麻、孜然、山奈、香料、桂皮、生产用水的细菌数量进行测定，采用传统培养法结合16S rDNA测序对其中含有的主要菌群进行鉴定，结果发现自贡冷吃兔生产所用的原料肉、辣椒、孜然、香料含菌量高，其中原料肉细菌总数对数值高达7 CFU/g以上，辣椒、孜然、香料细菌总数对数值位于4～5 CFU/g，是自贡冷吃兔产品潜在的细菌污染源；花椒、八角、芝麻和桂皮清洁度较高，符合GMP规定原辅料要求；生产用水菌落总数超标，不符合企业卫生标准。从自贡冷吃兔生产所用原辅料中共分离76株菌，分布于20个属，其中芽孢杆菌属在辅料中普遍存在，从山奈中分离鉴定的6株菌全属于芽孢杆菌属。根据不同原辅料菌落总数从大到小为：兔肉＞孜然＞辣椒＞香料＞生产用水＞山奈＞八角＞桂皮＞花椒＞芝麻；属水平数量排序为：原料肉＞辣椒、孜然＞香料、生产用水＞花椒、八角、芝麻、桂皮＞山奈；种水平数量排序为：原料肉、香料、桂皮＞辣椒＞八角＞山奈、花椒＞芝麻、孜然、生产用水。通过同源性分析，确定腐败样品中芽孢杆菌属细菌来源于芝麻、山奈，葡萄球菌属细菌来源于生产用水，原料兔肉是乳杆菌属的主要污染源。

3.2 本研究丰富了自贡冷吃兔原辅料中细菌数据库，为自贡冷吃兔微生物控制提供了理论支撑，同时也为川菜工业化产品腐败菌多样性研究提供参考。下一步研究，可根据潜在细菌污染源，在实际生产中制定合理有效的消杀措施，从源头与过程把控产品初始菌数量与种类；针对优势腐败菌，探讨合理高效的防腐保鲜技术，提高产品货架期。