红参-胶原蛋白肽复配饮品对小鼠造血能力 和免疫调节功能的影响

刘会平，邓玉娣，涂亚莉，尹汉通，王琳清，魏茜，杨晓娜，廖文镇*，蒋亮*

（1.时代生物科技（深圳）有限公司，广东深圳 518115）（2.南方医科大学公共卫生学院，广东广州 510515）

随着社会经济水平升高、生活节奏不断加快，人们也追求更高的物质生活水平。目前市面上存在的饮料已经不能满足人们的需求，大部分人期望饮料能具有较高的营养价值，如增强免疫力、美白等。因此，大量的功能性饮料也应运而生。查阅大量资料可知，人们已经研究出了各种各样的功能性饮品，这些饮品大多有抗氧化作用[1,2]，或有增强免疫功能[3,4]等效用。随着日益沉重的社会压力和残酷的社会竞争力，机体免疫能力低下已成为危害现代人健康的重大隐患之一。此外，受到2020年新冠肺炎疫情的影响，人们对自身健康越来越重视，“免疫力”一词也逐渐成为消费者关注健康的关键词。免疫健康将是功能性食品饮料未来的发展大趋势和重要增长动力。此外，目前市面上同时具有抗氧化、补气血和免疫调节作用的固体饮料极少，迫切需要研发和丰富此类饮料。

近年来，复配饮品作为一种饮料新产品逐渐被人们接受并受到广泛好评。复配饮品是将具有不同营养成分的物质进行不同比例的搭配，使其功能互补，进而提高饮品的营养价值。红参为人参常用炮制品之一，是一种新资源食品，含有皂苷类、挥发油类、糖类、氨基酸类、微量元素等，主要具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和抗疲劳等作用[5]。阿胶肽具有抗氧化、增强免疫力、抗皱延衰、补水保湿和预防骨质疏松的作用[6]。除此之外，鱼胶原蛋白肽、酵母β葡聚糖、N-乙酰神经氨酸、鸡肉蛋白肽、桂圆粉、红枣粉、γ-氨基丁酸等活性成分均有补血止血、提高免疫力等作用。针对当前市场需求，通过将以上具有不同营养成分的物质国家固体饮料标准GB/T 29602，复配制成固体饮料。同时，验证其改善造血功能和提高机体免疫的效果，为其作为一款多功能的食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

复合固体饮料由时代生物科技（深圳）有限公司提供，主要成分为鱼胶原蛋白，是经过鱼皮预处理、煮胶、絮凝、棉滤、酶解等生产工艺获得，其主要成分经检测为小分子蛋白肽。当归补血口服液购自郑州市协和制药厂。总抗氧化能力（TAOC）检测试剂盒（FRAP法）、SOD试剂盒、抗氧化能力试剂盒（ABTS法）、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒等检测试剂购自南京生物。环磷酰胺购自上海源叶。

清洁级C57BL/6 6周龄雄性小鼠60只[许可证号：SCXK（粤）2018-0002]，体质量20～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验过程中，所有的实验操作均在《实验动物管理条例》[7]的规定下进行，并且符合规定。将实验室温度设置在20～25 ℃，湿度60%～80%，让动物自由饮食。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅，扬州三发电子公司；Legend Micro17低温离心机，美国Thermo；UV-1800可见分光光度计，日本岛津；ELX08酶标仪，美国Bioteck；AA-160电子天平，美国DENVER；FCD-217SEN冰箱，中国海尔。

1.3 试验方法

1.3.1 固体饮料配制

在净化条件下，将国家新批准的食品与具有抗氧化、增强免疫力作用的天然产物，经过粉碎、过筛和称量，并按照不同比例进行混合配制，配制完成后再进行灌装等工序，经检验合格。配方见表1。

表1 复合固体饮料的配方 Table 1 Formula of composite solid beverage

1.3.2 食用方法

2.21 g装复合固体饮料溶于50 mL水中，直接饮用。

1.3.3 抗氧化作用评价

1.3.3.1 ABTS自由基清除率

将标准品原液用蒸馏水分别稀释成1、0.5、0.25、0.13、0.062、0.031、0 mmol/L浓度，取上述不同浓度的标准品稀释液（10 μL）和不同浓度的样品溶液（10 μL）分别加入含有ABTS自由基溶液的检测溶液（190 μL）中，混匀之后室温反应6 min，在405 nm波长下测定样品的吸光度值。同时用10 μL蒸馏水代替样品溶液，进行空白对照组实验，每个浓度重复3次。

1.3.3.2 总抗氧化能力TAOC

标准曲线绘制：将20 μmol/mL FeSO4标准溶液等比稀释（0.4、0.2、0.1···），吸取100 μL标准溶液和蒸馏水（作空白），分别加入100 μL试剂盒检测试剂二，充分混匀，反应10 min，用双蒸水调零，测定A593nm，计算∆A=A标准-A空白。

首先预热分光光度计或酶标仪30 min以上，将波长调至593 nm，同时用蒸馏水调零。取混合检测试剂180 μL、不同浓度的样品6 μL、双蒸水180 μL，充分混匀，反应10 min，双蒸水调零，吸取200 μL于96孔板，测定593 nm吸光值。计算∆A’=A测定-A对照。

以Fe2+终浓度为横坐标，以∆A为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程y=kx+b，将∆A’带入方程求得x（μmol/mL）。计算公式（根据试剂盒说明书提供，按液体体积计算）：

总抗氧化能力/(μmol/mL)=x×v反总÷v样=34×x。

式中：

v样总——加入提取液的体积（1 mL）；

v反总——反应总体积（0.20 mL）；

v样——反应中样品体积（0.006 mL）。

1.3.4 免疫调节作用评价

1.3.4.1 气血双虚模型建立与分组干预：

参考Gao等[8]的方法进行造模。从动物中心引进60只小鼠，适应性饲养1周后，随机选取50只用于造模，造模4 d。造模第1 d，造模组每只小鼠尾部放血0.25 μL/g，在第2 d腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，在第4、6、8天腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，注射前禁食不禁水12 h。剩余10只小鼠尾部不放血，腹腔注射同等体积的生理盐水（作空白对照组）。

将随机选取的50只气血双虚模型小鼠随机分为5组，每组10只，高（400 mg/kg）、中（200 mg/kg）、低（100 mg/kg）剂量组分别灌胃复配饮料，阳性对照组灌胃当归补血口服液（6.60 mL/kg），模型组仅灌胃同等体积的生理盐水（20 mL/kg），1次/d，连续灌胃15 d。于末次给药2 h后观察小鼠的整体情况，然后尾部取血进行相关指标检测。

1.3.4.2 基本情况

观察小鼠的活跃度、毛发颜色光泽整齐度、鼠耳鼠尾等情况，记录小鼠体重变化。

1.3.4.3 全血细胞检测

灌胃15 d后，禁食12 h，称重。各组动物眼眶取血，随后使用全自动血液细胞分析仪（BC-2800vet）对小鼠全血进行分析。

1.3.4.4 脏器指数与病理切片

解剖小鼠后，收集小鼠内脏先用生理盐水冲洗，再用滤纸吸干并称重，计算脏器指数。将一部分脏器用多聚甲醛溶液浸泡固定，用于制作病理切片，余下的部分则装入冻存管，贮存于-80 ℃冰箱中待用。

病理切片的制作过程[9]：样品浸泡在多聚甲醛中48 h后，修整组织，用无水乙醇脱水，二甲苯透明组织后，将组织进行浸蜡包埋处理。随后将蜡块切片，贴片，脱蜡，染色，中性树胶封存。最后使用显微镜观察切片，并拍照。

1.3.4.5 氧化应激评价

用试剂盒测定小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量水平[10]。操作步骤和分析过程均按照相应试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0软件完成统计工作，数据以XSD± 表示，多组之间采用方差分析比较，组间比较采用t检验，显著水平为p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 复合固体饮料的抗氧化作用

如图1所示，ABTS标准曲线的决定系数R2=0.9996，表明标准曲线的相关性较高。ABTS+·是一种人工合成自由基，因其较稳定常用于检测抗氧化能力。该自由基在414、645、734和805 nm处可获得最大吸收峰。ABTS+·与抗氧化剂反应之后变成无色的ABTS，通过检测吸光度的变化测量抗氧化剂抗氧化作用的能力[11]。测得的结果以trolox equivalent antioxidant capacity trolox当量抗氧化能力表示，即被测抗氧化剂清除ABTS+·的能力（吸光度大小的变化）与标准抗氧化剂trolox（VE的水溶性类似物）清除ABTS+·的能力的比值。由图3可知，红参鱼胶原蛋白肽复配饮品均有比较高的ABTS清除能力，具有一定的体外抗氧化能力，并且，随着浓度增加，样品的ABTS自由基清除率也随之提高。

图1 ABTS标准曲线 Fig.1 The standard curve of ABTS

图3 样品的ABTS自由基清除率 Fig.3 The ABTS free radical scavenging rate of the samples

TAOC是反映活性物质抗氧化性能的一个重要指标[12]。其检测原理是，Fe3+被还原后可与斐林类物质结合形成稳定的络合物，通过比色反应检测其抗氧化力。由图2可知，TAOC标准曲线的决定系数R2=0.9998，表明TAOC标准曲线的相关性较高。由图4可知，本复配饮品具有一定的抗氧化能力，在100 mg/mL浓度下，总抗氧化能力可达0.25 U/mL；且在其他条件一致下，随着浓度升高，其抗氧化能力也逐渐增强。

图4 样品的抗氧化活性（TAOC） Fig.4 The antioxidant activity (TAOC) of the samples

2.2 复合饮料对气血两虚模型小鼠基本情况的影响

实验期间，空白对照组小鼠活动及皮毛颜色均正常；而模型组小鼠活动减少，小鼠尾部和耳尖毛色明显变浅，被毛粗乱、蓬松、欠缺光泽；三种不同剂量（高、中、低）干预组与当归补血口服液（阳性）组小鼠的活跃度及精神状态随着时间的延长均有所好转。由图5和图6可知，实验初期，各组小鼠体重无明显差异，且小鼠体重随时间的增长均有不同程度的增加，其中，对照组的体重有明显增加，p＜0.05，差异有显著性，且增长速度较快。其他组小鼠，由于进行了放血和注射环磷酰胺的操作，比较虚弱，体重比对照组轻，一定剂量的饮品组干预后，体重有所上升。但在本实验中，差异不显著，这可能是由于干预时间较短。

图5 小鼠体重变化曲线 Fig.5 The change curve of mice body weight

图6 小鼠初始体重与最终体重 Fig.6 Initial and final body weight of mice

2.3 复合饮料对气血两虚模型小鼠血常规的影响

血常规是目前临床上常用的基本检测指标，可以初步判断机体的生理及病理状态，其中，白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞是机体白细胞的重要组成部分，在免疫系统中起着核心作用。红细胞、血红蛋白主要反映机体的造血功能，而血小板主要功能是止血。如表2所示，与对照组相比，模型组小鼠血常规指标（如淋巴细胞、血小板、白细胞和中性粒细胞）水平均显著降低，p＜0.05，差异有显著性，说明复制气血双虚模型成功。这与刘培建等的动物造模结果基本吻合[13]。与模型组相比：高剂量饮料组能显著升高（p＜0.05）小鼠全血中的淋巴细胞、白细胞和血小板水平，使其趋近于正常水平，提示本复配饮品可以显著改善气血双虚小鼠的造血功能，同时对免疫功能也有较好调节作用。与模型组相比：阳性药物组（当归补血口服液）也能升高小鼠血常规指标（白细胞、淋巴细胞和血小板），p＜0.05，差异结果具有显著性，使其趋近于正常水平。白细胞数目和淋巴细胞数目与免疫力相关，而血小板数目则与凝血功能有关。从以上结果可知，服用红参鱼胶原蛋白肽饮品的小鼠相比于气血双虚模型小鼠，白细胞、淋巴细胞和血小板的数目均得到了恢复，小鼠的免疫力和凝血功能也有所提高，可证明本复配饮品可以改善气血双虚所致的小鼠血常规指标降低和免疫力下降的现象，可增强气血双虚小鼠的血液系统和免疫系统能力，具有改善小鼠造血功能的效果。

表2 各组小鼠的血常规情况 Table 2 Blood routine conditions of mice in each group (¯X±SD, n=5)

2.4 复合饮料对气血两虚模型小鼠脏器指数与脾脏病理的影响

免疫器官按其功能可分为中央免疫器官和外周免疫器官。中央免疫器官主要包括骨髓和胸腺，是免疫细胞发生、分化和成熟的地方。外周免疫器官主要包括脾脏、淋巴结和其他淋巴组织，是免疫细胞沉降、增殖和发生免疫反应的场所[14]。脾脏和胸腺作为重要的免疫器官，复合饮料对脾脏指数和胸腺指数的影响可作为研究动物模型免疫机制的初步指标。由表3可知，模型组小鼠的胸腺指数与脾脏指数相比对照组均有显著降低（p＜0.05）。而一定剂量的复配饮品干预后，这两个脏器指数均有所增大。其中，中剂量组的小鼠胸腺指数相比模型组有所增大（p＜0.05）；中、高剂量组小鼠脾脏指数相比模型组显著增大（p＜0.05）。6个组之间的肝脏指数差异无统计学意义。以上结果均说明，本复配饮品可有效调节气血双虚小鼠的免疫力。

表3 各组小鼠的脏器指数 Table 3 Organ indices of mice in each group (¯X±SD, n=5)

对小鼠脾脏行HE染色（图7），可以看到，正常对照组小鼠脾小结大而多、脾脏红润且白髓清晰，脾中央周围淋巴细胞密度较大。而模型组小鼠的脾脏结节数量和面积显著减小。复配饮品干预组与阳性药物组小鼠的脾脏形态与模型组相比，小鼠脾小结数目增多且面积增大，脾脏更为红润，白髓更清晰，且细胞密度显著增加，趋近于正常对照组脾脏形态。上述病理分析表明，本复配饮品可明显改善由气血双虚所致的脾脏损害。

图7 各组小鼠的脾脏切片 Fig.7 Spleen sections of mice in each group

2.5 复合饮料对气血两虚模型小鼠氧化应激的影响

氧化应激是指机体在受到内外界有害刺激时，体内氧化系统和抗氧化系统失衡，导致其在体内大量积累超出组织负荷，从而引发组织发生氧化损伤的过程[15]。超氧化物歧化酶（SOD），在体内可与O2-·发生抗氧化反应，将对机体有害的物质转化为无害的物质，显著降低机体的氧化应激水平[16]。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内常见的一种重要的过氧化物分解酶。主要是催化谷胱甘肽（GSH）参与过氧化反应，促进游离过氧化氢和脂质过氧化物的分解，以及清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用[17]。在机体内，自由基可作用于脂质发生过氧化反应，产生丙二醛（MDA），而MDA又会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合反应，且具有细胞毒性。据研究发现，MDA含量可通过机体脂质过氧化速率和强度直接反映机体潜在抗氧化能力，同时也能反映组织过氧化损伤程度[18]。而氧化应激与免疫功能存在关联[19,20]。免疫细胞的细胞膜中含有不饱和脂肪酸，所以对氧化应激十分敏感，在受到自由基攻击后，免疫功能极易受到影响[21]。在前述体外实验中，已证实复合饮料具有体外抗氧化作用。接下来，对其体内抗氧化作用进行研究。由图8可以看出，模型组相比于对照组，GSH-Px活性和SOD活性均显著降低，而MDA含量显著升高，差异有统计学意义（p＜0.01），说明模型组小鼠处于氧化应激状态。低、中、高三组剂量小鼠与模型组相比，GSH-Px与SOD酶活性均有所升高，差异具有统计学意义（p＜0.05）。此外，高剂量组的MDA含量显著低于模型组（p＜0.05）。这提示，此饮品可显著增强气血两虚小鼠抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性同时降低MDA的含量，具有提高气血两虚小鼠抗氧化能力的作用。

图8 饮料对小鼠氧化应激指标的影响 Fig.8 The effect of beverages on oxidative stress indicators in mice

3 结论

本研究结合当前市场需求，以红参、阿胶肽为主要原料，以鱼胶原蛋白肽、酵母β葡聚糖、N-乙酰神经氨酸、鸡肉蛋白肽、桂圆粉、红枣粉、γ-氨基丁酸为辅料，开发出了一种复合功能饮料，同时考察该饮料的抗氧化能力、对机体免疫功能的影响。结果证明，此固体饮料具有清除自由基的能力，在100 mg/mL浓度下，总抗氧化能力可达0.25 U/mL，显著增强了小鼠的抗氧化能力，减轻氧化损伤。红参中含有皂苷、糖类、氨基酸类等营养物质，具有较强的抗氧化活性，而其总抗氧化能力与红参中的皂苷和还原糖显著相关，因此本饮品具有较好的抗氧化能力很可能与其将红参作为主要原材料有关。此外，阿胶肽具有预防骨质疏松、增强免疫力和抗氧化等功能；鱼胶原蛋白肽、酵母β葡聚糖、N-乙酰神经氨酸、鸡肉蛋白肽、桂圆粉、红枣粉、γ-氨基丁酸等成分均具有补血止血、提高免疫力的作用。在本实验中，增强了气血双虚模型小鼠的免疫力和凝血功能，对脾脏损伤有改善作用，可降低MDA的含量及增强小鼠抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性。在本次实验中，模型组小鼠的胸腺指数与脾脏指数与对照组相比均显著降低（p＜0.05）。而一定剂量的饮品干预后，这两个指数均有所增大。其中，中剂量组的小鼠胸腺指数显著大于模型组（p＜0.05）；中、高剂量组的小鼠脾脏指数显著大于模型组（p＜0.05）。此外，该饮品对气血双虚小鼠的血液系统也有一定的增强作用，起到了改善造血功能的效果。该复合饮料不仅风味独特，而且还具有抗氧化，改善造血功能和增强免疫功能的功效。综上可知，这款复合饮料携带服用方便，配方科学合理，制造方法容易，是一款极具开发潜力的食品，在食品行业有着广阔的应用前景。后续可以就该功能饮料在调节免疫功能及其作用机理上作更深入的研究。