栽培草莓潜在印记基因FaTRG-31的克隆与特征分析

安 琪，张 红，怀欣佳，荆晓彤，熊劲松，乔玉山

(南京农业大学 园艺学院， 南京 210095)

水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是一类能通过在细胞膜上组成“孔道”并高效转运水分子的内在蛋白。AQPs包括6个跨膜螺旋(TM1～TM6)、5个连接它们的环(A-E)[1]、2个高度保守的NPA(asparagine-proline-alanine)基序[2]、Ar/R(芳香/精氨酸)选择性过滤器。AQP具有运输水和其他底物的功能，通过NPA基序和Ar/R区域的氨基酸残基帮助其进行底物的选择，加强通道的特异性。植物水通道蛋白主要有5类：质膜内在蛋白(plasma intrinsic proteins, PIPs)、液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs)、类NOD26膜内在蛋白(nodulin-26 like intrinsic proteins, NIPs)、小分子碱性膜内在蛋白(small basic intrinsic proteins, SIPs)和X内在蛋白(X intrinsic proteins, XIPs)[3]。

PIPs分为PIP1型和PIP2型。PIPs参与吸收和运输水、尿素[4]、硼酸[5]和二氧化碳[6]等，其主要功能是通过调节植物细胞渗透势来介导水分子的跨膜运输，进而参与调节植物生长发育的诸多过程[2, 7-8]。研究表明，PIPs家族在苹果、番茄、葡萄等多种植物中被发现与种子和果实发育有关[9-11]。此外，当植物抵御干旱、盐和渗透胁迫时，植物细胞的PIPs通过发生表达水平、蛋白结构等不同的适应性改变，从而发挥重要作用[12-13]。草莓中水通道蛋白的相关报道较少，二倍体草莓中确定了10种AQP，属于PIP和TIP亚家族[14]。栽培草莓中鉴定出9种AQP，分别是FaRB7、FaPIP1;1、FaPIP2;1、FaNIP1;1、FaPIP1;2、FaPIP1;3、FaPIP2;1(b)、FaPIP2;2和FaTIP(a)。研究表明，FaRB7启动子可以诱导草莓根特异性表达[15]；FaPIP1;1表达模式与生长素和成熟过程密切相关[16]；FaPIP2;1基因编码具有高透水性的水通道，其表达模式与果实硬度相关[17]；FaNIP1;1主要在果实中表达并具有与成熟相关的表达模式，受脱落酸正调节，生长素负调节[18]；FaPIP1;2各组织均有表达且差异不显著，FaPIP1;3为叶特异性表达，FaPIP2;1(b)主要在地上营养组织中表达，FaPIP2;2在叶片和叶柄中的表达明显高于果实组织，FaTIP(a)果实中的表达较高[19]。本课题组前期通过转录组测序发现的一个栽培草莓潜在的印记基因FaTRG-31(turgor-responsive protein 31)，研究表明TRG-31属于质膜内在蛋白(PIPs)家族[20-21]。

Kermicle等于1970年发现，玉米中R基因的某些等位基因从一个亲本遗传时产生完全着色的籽粒，而从另一个亲本遗传时则不会产生[22]，首次在植物中发现印记基因。基因组印记(genomic imprinting)是指亲本染色体上等位基因的表观遗传修饰差异而导致只有一个等位基因表达，另一个沉默或者表达量低的现象。具有这种父母本差异表达现象的基因被称为印记基因。根据印记基因的亲本来源不同可以分为两种类型：母源印记基因(maternally expressed imprinted gene，MEGs)和父源印记基因(paternally expressed imprinted gene，PEGs)[23]。现已在真菌、哺乳动物和开花植物中鉴定出印记基因，开花植物中的印记基因主要在胚乳中表达，只有少数印记基因在胚中被报道[24]。随着高通量技术的成熟和应用为印记基因的鉴定提供了更高效的方法。在拟南芥和水稻中通过系统的全基因组测序已鉴定出上百个印记基因[25-31]，但其中大多数尚未得到证实且没有明确的功能。目前草莓中，通过传统的实验手段仅我们在森林草莓(FragariavescaL.)中鉴定出5个印记基因，分别是FvARI8、FvBRO1、FvKHDP-2、FvDRIP2和FvLTP3[32]，但仍缺乏对草莓印记基因表达模式及生物学功能的研究。FaTRG-31作为栽培草莓中潜在的印记基因，为明确该基因的印记类型及表达特征，本研究从栽培草莓‘红颜’中克隆得到该基因，并对其表达模式、印记特性等进行初步分析，以了解该基因的作用机理进而为草莓印记基因表达调控机制及生物学功能的深入研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为八倍体栽培草莓‘红颜’(B)和‘甜查理’(S)，种植于南京农业大学白马教学基地。收集‘红颜’草莓的根、短缩茎、叶、花萼、花瓣、花药、花托、子房、花柱、12 DAP(days after pollination)的胚及胚乳、种皮，‘甜查理’草莓12 DAP的胚乳，B(♀)×S(♂)、S(♀)×B(♂) 12 DAP的胚乳，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。试验所用质粒为pCAMBIA1302-GFP，所用大肠杆菌菌株为DH5α，农杆菌菌株为EHA105，烟草为本氏烟草(NicotianabenthamianaDomin)。

1.2 方 法

1.2.1FaTRG-31的克隆与生物信息分析以‘红颜’草莓12 DAP的胚乳为材料，总RNA提取参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Tiangen)说明书进行。凝胶电泳检测完整性后利用PrimeScript Ⅱ1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA。在GDR数据库(https://www.rosaceae.org/)中搜索maker-Fvb7-1-augustus-gene-257.46-mRNA-1获得草莓FaTRG-31基因序列，利用DNAMAN设计扩增引物(表1)。以‘红颜’12 DAP的胚乳cDNA为模板，按照2×Hieff Canace®Gold PCR Master Mix(翌圣)说明书进行PCR扩增。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳并回收目的条带，连接pClone007 Blunt Simple(007BS)载体(擎科)，转化大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆由公司完成测序。

利用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal P5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)等在线网站对FaTRG-31进行蛋白质分子量、等电点、跨膜区、信号肽和亚细胞定位的预测。通过MEGA 7.0软件分析FaTRG-31氨基酸序列与拟南芥和葡萄中的PIP不同亚型蛋白序列之间的亲缘关系，采用Neighbor-Joining(NJ)法构建进化树，用Bootstrap重复1000次进行校正，其他参数默认[33]。

1.2.2 FaTRG-31亚细胞定位分析以pCAMBIA1302-GFP植物表达载体为基础，设计带有酶切位点BglⅡ和SpeⅠ的载体引物(表1)对FaTRG-31编码区进行扩增，构建植物表达载体pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31。将构建好的表达载体和pCAMBIA1302-GFP空载体质粒分别转入农杆菌EHA105。参照Zheng等[34]的农杆菌介导法，将重悬后OD值为0.6左右的菌液注射到本氏烟草叶片。置于培养箱中培养2～3 d后在激光共聚焦显微镜下观察烟草叶片中的荧光信号并拍照记录。

1.2.3FaTRG-31的组织表达特性分析以‘红颜’草莓不同组织(根、短缩茎、叶、花萼、花瓣、花药、花托、子房、花柱、12 DAP的胚及胚乳、种皮)为材料提取RNA，并反转录为cDNA。根据FaTRG-31的编码区序列设计qRT-PCR引物(表1)，草莓内参基因为EF1-α[25]。检测‘红颜’草莓不同组织中FaTRG-31的表达水平。采用SYBR premix EX TaqTMreagent试剂盒(TaKaRa)进行qRT-PCR反应。反应体系(20 μL)为：SYBRpremixExTaq混合液10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 1.0 μL和ddH2O 8.0 μL。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40次循环。基因相对表达量通过2-ΔΔCt法[35]计算，试验进行3次生物学重复。

表1 引物序列及用途Table 1 Primers and their amplification

1.2.4FaTRG-31启动子的克隆及序列分析根据在GDR数据库中检索到的FaTRG-31基因序列，向起始密码子上游2 000 bp进行搜索，获得该基因所对应的启动子序列。根据启动子序列设计扩增引物(表1)。通过CTAB法提取‘红颜’草莓基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。将回收的片段连接至007BS载体并转化大肠杆菌DH5α后进行阳性克隆鉴定与测序。使用在线软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[36]分析FaTRG-31启动子中包含的顺式作用元件。

1.2.5FaTRG-31印记鉴定提取B、B(♀)×S(♂)、S(♀)×B(♂) 12 DAP的胚乳总RNA，并反转录为cDNA。以‘甜查理’12 DAP的胚乳cDNA为模板，根据GDR数据库中包含单核苷酸多态性(SNP)位点的基因片段设计特异性引物(表1)，在‘甜查理’中克隆该基因片段进行RT-PCR测序分析，结合之前克隆的‘红颜’FaTRG-31基因，获得可靠的SNP位点。利用该SNP位点区分亲本的等位基因，再以‘红颜’与‘甜查理’正反交12 DAP的胚乳cDNA为模板进行扩增。根据刘国庆等[37]的方法使用DNA测序峰图的面积来获得碱基变异的比例，利用Image J[38]软件计算DNA测序峰图面积以获得SNP位点碱基的变异比例。验证草莓胚乳中FaTRG-31的印记特性。

1.2.6FaTRG-31在非生物胁迫下的表达分析取12株生长于盆钵中长势一致的‘红颜’草莓正常浇水，经3 d的缓苗期后开始胁迫处理，4株置于4 ℃环境中模拟低温胁迫；4株浇灌300 mmol·L-1甘露醇溶液模拟干旱胁迫处理；4株浇灌100 mmol·L-1NaCl溶液模拟盐胁迫处理。分别于胁迫处理后0、12、24、48、72和96 h取不同处理的草莓叶片，液氮速冻，-80 ℃保存备用。以未经胁迫处理和胁迫处理后不同时间的‘红颜’叶片cDNA为模板，通过qRT-PCR分析FaTRG-31在非生物胁迫下的表达模式。内参引物、特异引物、反应体系、程序及数据分析同1.2.3。

1.3 数据分析

数据分析用SPSS 22软件进行，通过Duncan法进行显著性分析(P<0.05)，用Excel 2017制图。

2 结果与分析

2.1 FaTRG-31的克隆与生物信息分析

以‘红颜’草莓12 DAP的胚乳cDNA为模板进行PCR扩增，获得了大小约1 000 bp的单一条带(图1，A)，测序分析结果表明，该基因包含一个长为999 bp的完整开放阅读框，编码332个氨基酸。

ProtParam预测理化性质显示，FaTRG-31编码的蛋白质分子量约为33.6 kD，等电点为9.10，不稳定系数(instability index Ⅱ)为29.99，亲水性平均数(GRAVY)为0.370，属于稳定的疏水性蛋白。SignalP和TMHMM分析显示，FaTRG-31不含信号肽，且具有AQPs家族典型的6个跨膜区(分别位于氨基酸序列第99～121、136～158、178～195、224～241、254～276、302～324位)，是一类膜蛋白。WoLF PSORT预测结果显示，FaTRG-31定位在细胞质膜中。在线软件(https://prosite.expasy.org/)分析FaTRG-31的氨基酸序列，其中含有AQPs家族两个高度保守的NPA基序和SGGHINPAVT序列。此外，还含有水通道蛋白家族PIPs亚家族的高度保守序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VIVF/YN(图2)，说明FaTRG-31属于质膜内在蛋白(PIPs)家族。

将FaTRG-31蛋白序列与拟南芥和葡萄的PIP蛋白序列进行比对，利用MEGA7.0软件构建系统发育树(图3)发现，FaTRG-31与所有PIP1型质膜水通道蛋白的氨基酸相似性均高于90%，并与FaPIP1;1亲缘关系最近，相似性超过98%。

2.2 FaTRG-31的亚细胞定位

为确定FaTRG-31亚细胞定位情况，将FaTRG-31构建到pCAMBIA1302-GFP植物表达载体中，成功构建pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31融合表达载体，待质粒成功转化农杆菌EHA105后注射烟草叶片背面，并以空载为对照，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达情况。结果(图4)显示，在空载对照中荧光信号在细胞质、细胞核和细胞膜等部位都能观察到，而pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31融合蛋白只在细胞质膜上观察到荧光信号，说明FaTRG-31蛋白定位于细胞质膜上。这与亚细胞定位预测结果一致，且与PIPs家族其他成员定位结果一致[39]。由此得出FaTRG-31属于质膜内在蛋白(PIPs)家族。

2.3 FaTRG-31在不同组织中的表达模式

为明确FaTRG-31的表达特点，对草莓的根、短缩茎、叶、花萼、花瓣、花药、花托、子房、花柱、12 DAP的胚及胚乳、种皮等不同组织进行qRT-PCR分析。结果显示：FaTRG-31基因在‘红颜’草莓的不同组织中均有表达，在胚乳中的表达量最高，其次是花萼、短缩茎和花柱，子房最低(图5)。

2.4 FaTRG-31启动子作用元件分析

为了验证FaTRG-31启动子中是否存在胚乳表达相关的作用元件，以‘红颜’草莓的基因组DNA为模板，扩增出FaTRG-31起始密码子上游1 989 bp的启动子序列(图1，B)。通过Plant CARE在线网站对FaTRG-31启动子进行分析。结果显示，FaTRG-31启动子区除了含有启动子结合位点相关元件(TATA-box、CAAT-box)外，还有与胚乳表达相关的作用元件(GCN4-motif)，以及4种光响应元件(GT1-motif、Box4、G-box、TCT-motif)、2种激素响应元件(ABRE、TGA-element)、3种与干旱和盐等胁迫相关的响应元件(TC-rich repeats、MBS、MYC)(表2)，这可以部分解释该基因在胚乳中高表达的原因。

2.5 FaTRG-31印记鉴定

根据FaTRG-31基因在胚乳组织中高表达，植物中的印记基因同样也主要在胚乳中表达。为明确栽培草莓潜在印记基因FaTRG-31的印记特性，以‘红颜’、‘红颜’(♀)ב甜查理’(♂)、‘甜查理’(♀)ב红颜’(♂)正反交12 DAP的胚乳cDNA为模板，对预测含有SNP位点的基因片段进行扩增。结果显示(图6)，两亲本的FaTRG-31基因序列在570 bp处存在SNP位点。在‘红颜’做母本的杂交胚乳中，该SNP位点与亲本‘红颜’相同；而在‘甜查理’做母本的杂交胚乳中，该SNP位点与‘甜查理’相同。以上结果表明在此SNP位点处胚乳中等位基因的表达只和母本有关，即只表达母本的等位基因，不表达父本的等位基因，说明该基因是母源印记基因(MEG)。

2.6 FaTRG-31在不同胁迫处理下的表达分析

鉴于FaTRG-31启动子序列上含有多种与非生物胁迫相关的响应元件(MBS、TC-rich repeats)，同时PIPs类基因多与抗逆性相关。为进一步研究FaTRG-31的功能特性，分别采用低温、干旱和盐胁迫处理‘红颜’草莓，通过qRT-PCR方法检测胁迫处理后草莓中FaTRG-31的表达水平。结果显示(图7)，在4 ℃低温处理下，FaTRG-31的表达水平呈现先下降后上升的趋势，在48 h时出现最低值，然后逐渐升高，表明较长时间的低温条件上调该基因的表达。在干旱处理后，FaTRG-31在胁迫后12 h里小幅度上调表达，12 ～ 48 h内显著下调并低于对照水平，而后又在72 h时上调至12 h时的水平，表明干旱短时间上调该基因的表达。在盐胁迫处理后，FaTRG-31与干旱处理后表达模式类似。在前期小幅上调表达，之后转录水平迅速下调至低于对照，而后逐渐上调，在72 h时达到最高，复又下调至对照水平，表明盐胁迫下FaTRG-31也有较高水平的表达。通过了解FaTRG-31在低温、干旱及盐胁迫下的表达模式，推测该基因可能在草莓抵御低温和渗透胁迫过程中起作用。

3 讨 论

目前植物中已发现许多印记基因[24]，但关于草莓印记基因的研究还比较少。本研究从‘红颜’中克隆得到栽培草莓潜在印记基因FaTRG-31，通过生物信息学、系统进化树分析发现FaTRG-31编码的蛋白质属于典型的水通道蛋白(AQPs)家族中质膜内在蛋白(PIPs)亚家族[2, 40]。此外，FaTRG-31蛋白的亚细胞定位于细胞质膜，此结果与预测结果及前人研究相一致[41-42]，这进一步证实了FaTRG-31属于质膜内在蛋白家族。质膜内在蛋白(PIPs)家族中的不同成员表达模式不同[43]，有的组成型表达，如CsPIP1;2、CsPIP2;4和CsPIP1;3在子房、果实和花中高表达[44]；有的特异性表达，如PePIP2;7在叶中特异性表达，且主要在成熟叶片的叶肉细胞中表达[45]。本研究通过对FaTRG-31在‘红颜’各组织中的表达分析发现FaTRG-31在胚乳中高表达。植物体内基因表达受到严格调控，涉及到启动子、终止子等调控元件，其中启动子序列具有主导作用[46]。本研究进一步从‘红颜’草莓中克隆到了FaTRG-31基因上游1 989 bp左右的启动子序列，序列分析表明启动子上含有与胚乳特异性表达相关的作用元件(GCN4-motif)，这与FaTRG-31基因在胚乳中高表达相吻合，表明其可能在胚乳中发挥作用。研究表明，被子植物中的印记基因主要发生在胚乳，玉米[47]、拟南芥[48]中的印记基因均在胚乳中高表达，并且在种子早期发育过程中也有表达[49-50]。此外，印记基因还参与细胞分裂[27]、营养转移[51]、胚乳发育[52]和种子大小的调控[53]等生物学过程。FaTRG-31是前期通过转录组测序在栽培草莓中筛选出来的潜在印记基因，本研究在亲本中筛选出可靠的SNP位点，通过单等位基因表达进行印记验证。研究结果显示，草莓杂交胚乳中经验证的SNP位点处只表达母本的等位基因，不表达父本的等位基因，结合组织表达分析显示该基因在胚乳中高表达，说明FaTRG-31为印记基因且是母源印记基因(MEG)。对于该印记基因的具体功能和调节机制等一系列问题还需进一步研究。

高等植物基因的表达主要由启动子与转录因子的相互作用来调控，启动子的调控元件决定了基因的特定表达，其作用元件可以反映相应基因的功能[54]。除了与胚乳表达相关的响应元件，启动子中还有与干旱和盐胁迫相关的响应元件(TC-rich repeats、MBS、MYC)。印记基因FaTRG-31属于PIPs家族，研究表明多数PIPs家族基因在植物抗逆分子机制中参与应答反应[55-56]。TaAQP7和TaAQP8在烟草中的过表达分别导致对干旱和盐胁迫的抗性提高[55,57]；过表达PIP1;2基因的香蕉植物表现出对干旱、盐分和寒冷胁迫的抵抗力增强[58]；香蕉MaPIP1;1在拟南芥中的异源过表达通过减少膜损伤、改善离子分布和维持渗透平衡来增加对盐和干旱胁迫的耐受性[59]。草莓中也有相关研究表明，RdreB1BI通过激活草莓中的AQP相关基因来增强抗旱性[60]。本研究通过实时荧光定量PCR探究了非生物胁迫处理下印记基因FaTRG-31的表达模式。结果显示，低温胁迫下该基因表达模式表现为短时间下调而后逐渐上调；干旱胁迫下的基因表达模式和盐胁迫下基因表达模式相似，均表现为前期小幅度上调而后下降复又上调表达。总体来看，长期低温和早期的渗透胁迫时均上调表达，这与大麦叶片在胁迫下HvPIP1;6转录水平的增加表现一致[61]。此外，有研究表明拟南芥胚乳印记基因SDC会在非生物胁迫处理下被激活表达[62]。这暗示印记基因可能参与了植物对低温、干旱和盐等非生物胁迫的响应。通过了解FaTRG-31在非生物胁迫下的表达模式，推测该基因可能在草莓抵御低温和渗透胁迫过程中起作用，这仍需进一步通过转基因手段进行验证。